[发明专利]一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法

权利要求书

1.一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.制备胶原3D支架；

S2.采集脂肪组织，分离脂肪细胞，以MSCs培养基培养收获P0代MSCs，P0代MSCs以MSCs培养基重悬，培养收获P1代MSCs；

S3.预处理胶原3D支架；

S4.以MSCs培养基重悬P1代MSCs，接种至含胶原3D支架的组织培养皿中，使用NPCs培养基继续培养6天，收获NPCs。

2.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述制备胶原3D支架的方法为：将胶原海绵修剪成片，将若干个胶原海绵片垛叠在一起为一个培养单位，以含重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白的DMEM/F12浸泡，孵育过夜，以生理盐水浸泡漂洗，淋干后置于无菌密封容器中，于4℃保存不超过30天，备用。

3.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2中分离脂肪细胞的方法为：剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状；用生理盐水重悬离心后取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，37℃水浴30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物，筛网过滤，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置，吸弃悬浮物后离心弃上清。

4.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2中培养收获P0代MSCs的方法为：以MSCs培养基重悬脂肪细胞，调整细胞密度为5×10⁵/mL，接种至组织培养瓶中，于CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；400g离心5min，弃上清，收获沉淀物；生理盐水洗涤后，以细胞筛过滤，滤液400g离心5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代MSCs。

5.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2中培养收获P1代MSCs的方法为：P0代MSCs以MSCs培养基重悬，调整细胞密度为6000个/cm²，接种至组织培养瓶，于CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获P1代MSCs。

6.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤3中预处理胶原3D支架的方法为：将5片直径8cm的胶原3D支架垛叠在一起，置于组织培养皿中，加入MSCs培养基，置于于37℃，5%CO₂培养箱内培养过夜，取出胶原3D支架，淋干培养基，转移至新的组织培养皿中备用。

7.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，培养收获NPCs的方法为：以MSCs培养基重悬P1代MSCs，调整细胞密度至2×10⁶/mL，吸取30mL细胞悬液，接种至含胶原3D支架的15cm组织培养皿中，置于于37 ℃，5%CO₂培养箱内培养4天，取出胶原3D支架，淋干培养基，转移至新的15cm组织培养皿中，补充30mL NPCs培养基培养6天，收获；收获时吸弃NPCs培养基，生理盐水浸泡5分钟，更换若干次生理盐水至无色，加入消化液室温消化10分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；吸取消化液，以生理盐水洗涤胶原3D支架，合并消化液和洗液，以细胞筛过滤，滤液400g离心5min，弃上清，收获沉淀物，即为NPCs。

8.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述NPCs培养基为含有如下物质的DMEM/F12：

1 × B27，

10%无动物源成分血清替代品，

0.1nM人二氢睾丸酮，

40ng/ml全反式维甲酸，

50ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，

25ng /mL重组人表皮生长因子，

2mM L-谷氨酰胺。

9.根据权利要求1所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述脂肪组织来源于腹部脂肪。

10.根据权利要求9所述的一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，其特征在于，采集脂肪组织前对脂肪提供者体检，提供者应无肿瘤史、无病毒感染、无支原体感染，采集后立即置于含保存液的冰浴无菌瓶中，所述保存液为含有50ug/mL硫酸庆大霉素的DMEM/F12。