[发明专利]发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及转移疾病中的应用。

背景技术

近5年中因恶性肿瘤造成的死亡在全球死亡疾病谱中一直居于首位，而因恶性肿瘤死亡的患者中又以肺癌患者人数居多。根据病理类型可将肺癌分为两大类，分别是小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。众所周知，癌症患者往往死于癌症转移所造成的并发症，而不是原发肿瘤本身。既往临床资料表明，不止中晚期的肺癌患者会出现转移，即使是接受过根治性治疗的早期肺癌患者，仍会有很高的概率出现复发和转移。

癌症的转移是一个包含了很多关键事件复杂过程：理论上肿瘤细胞需要首先从原发病灶中分离，突破基底膜结构，然后通过自身发生变形迁移进入血液循环；或者由于其他原因直接进入血管或淋巴系统，之后还需要在血液中成功存活并停留在靶器官处，重新进行自我复制并最终形成临床可见的远处转移病灶。随着实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)、流式细胞术、密度梯度离心、免疫磁珠分选等技术的出现，人们在大多数癌症患者的外周血中检测出了肿瘤细胞，并把这种存在于血液循环中的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)。CTCs的发现部分验证了关于肿瘤转移机制的“种子与土壤”的假说，并促使我们从一个新的视角对肿瘤转移这个概念进行思考，循环肿瘤细胞是联系肿瘤原发灶和转移灶之间的桥梁，通过对肿瘤循环肿瘤细胞进行研究，可以对肿瘤转移的生物学机制获得更好的认识。

研究者认为，即使不是全部，肿瘤原发灶也是CTCs的重要来源之一，据估算，癌症患者体内大约存在有8000～120000个循环肿瘤细胞。患者外周血中CTCs数量越多，患者生存时间越短。但这些CTCs的性状之间存在着较大的差异，有的是单个细胞，有的是细胞团，有的与血细胞之间关系密切，还有一部分是没有活力的死细胞。考虑到CTCs数量与临床转移灶之间的巨大差距，有理由推测，真正能成功定植在靶器官并最终成为新的转移灶的CTCs应该只是这些细胞中某种亚型。因此肿瘤干细胞的学说近来逐渐引起研究者们的重视，该理论认为，不是所有的肿瘤细胞都有形成肿瘤的能力，肿瘤组织的不断增长是由于肿瘤干细胞自我复制和分化的结果。目前，这一猜测已在动物模型上得到了部分验证，实验结果表明，大部分CTCs在进入循环系统不久之后便已死亡，只有约0.01％-2.5％的CTCs可以形成转移灶。而某些表达正常干细胞标志的如CD44、CD133的乳腺癌细胞亚群则拥有与正常干细胞相似的特性，并且具有更强的成瘤能力。

临床检测结果表明，在非小细胞肺癌患者外周血中的一部分循环肿瘤细胞发生了上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。EMT是指上皮细胞间紧密连接蛋白表达量减少，细胞微丝、骨架蛋白表达量增加；同时细胞形态由上皮细胞形态(细胞间紧密连接，有极性)向间质细胞形态(细胞便为纺锤形，变形和移动能力增强)转变。现有结果表明，当肿瘤细胞发生EMT后，其侵袭转移能力增加、凋亡减少、对常规化疗药物或靶向治疗药物的抵抗性均明显增强。

根据上述理论和实验结果，我们推测，这些NSCLC患者外周血中发生了EMT的循环肿瘤细胞亚群很可能是就是肺癌肿瘤干细胞所在的亚群。如果能对此种细胞进行表型和基因型特性的深入研究，可以极大的促进我们对肿瘤转移相关机制的认识，并为新的抗癌药物的研发提供潜在的治疗靶点。但由于此类细胞数量稀少，受目前技术手段和伦理的限制，我们难以获得足够的样本或对临床患者进行长期的连续观测。因此，我们尝试制作一种可连续观测肿瘤进展情况的人肺腺癌原位移植动物模型。从模型上分离发生EMT的CTCs，检测并比较其与原始肿瘤细胞的生物学特性和基因差异，探究EMT和CTCs在肺癌转移过程中所扮演的角色和作用。为CTCs和EMT的研究提供新的研究思路和方法，并对肺癌的诊断和治疗提供一定的理论基础和研究方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植肿瘤模型的建立方法。

本发明的第二个目的是，提供一种肺腺癌循环肿瘤细胞的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供一种肺腺癌发生上皮间质化的循环肿瘤细胞的制备方法。

本发明的第四个目的是，提供一种发生上皮间质化的循环肿瘤细胞。