[发明专利]一种过表达MGST1基因人肺腺癌细胞的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的，涉及一种能够过表达MGST1基因的人肺腺癌细胞的构建方法及其应用。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在我国及全世界均高居首位。肺癌按病理组织类型分为两种，即非小细胞肺癌

(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中NSCLC约占肺癌类型的80％。肺腺癌是最常见的NSCLC组织类型之一，其发现时常处于晚期，预后较差，因肺腺癌而造成的死亡数居我国所有癌症相关性死亡数的第一位。针对肺癌的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和生物治疗，虽然近年疗效有较大的进展，但5年生存率仍不足15％，预后较差。因此探索肺腺癌的发病机制，探寻治疗肺腺癌新的治疗靶点具有重大意义。

基因工程(genetic engineering)，又称为基因重组技术，是以分子遗传学为理论基础在体外对DNA进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因免疫、基因治疗、基因疫苗等。其三要素分别为：载体、目的基因、工具酶。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。

MGST1基因编码的蛋白在肝脏中高表达，通过催化亲核性的谷胱甘肽和各种亲电子试剂的结合反应发挥解毒作用，因此，MGST1在肿瘤化疗药物耐药方面研究较多。近几年研究报道MGST1在食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达增高，其机制未阐明，同时其在人肺癌中的研究未见报道。

鉴于以上MGST1在其他的恶行肿瘤中高表达的现象，以及基因重组技术的优势，同时为了对肺腺癌细胞进行更多的研究，本发明采用基因重组技术，针对MGST1基因，构建重组真核表达载体pcDNA3-MGST1，并将其转染低表达MGST1的人肺腺癌细胞，构建稳定转染MGST1基因的细胞株，为研究MGST1功能提供了良好工具，亦为进一步研究MGST1基因在肺腺癌等恶性肿瘤中的生物学功能打下基础，同时也为研究肺腺癌及其它恶性肿瘤中MGST1基因的功能提供有效实验方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的稳定过表达真核重组质粒的肺腺癌细胞及其制备方法，并证明所述稳定过表达重组质粒pcDNA3-MGST1的肺腺癌细胞为功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人肺腺癌及其它恶性肿瘤中MGST1基因的功能提供有效实验方法。

人MGST1基因已在GenBank注册，注册号NM_001260511.1，定位于12p12.3，全长937bp，编码155个氨基酸，其核苷酸序列为图10中所述。我们前期研究结果发现人MGST1基因在人肺腺癌组织中高表达。本发明所述的真核重组质粒，由图11所示的核苷酸序列中的MGST1目的片段与真核载体pcDNA3构建而成，所述MGST1目的片段是起始密码子下游84bp～551bp的核苷酸序列。

一种pcDNA3-MGST1真核重组质粒转染SPC-A-1细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)通过PCR(聚合酶链式反应)合成人的MGST1目的基因片段；

(2)将上述获得的MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒，其中该插入MGST1目的基因的酶切位点分别为HindⅢ和KpnⅠ。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；

(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。

(4)将上一步中获得序列正确的重组质粒pcDNA3-MGST1转染SPC-A-1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC-A-1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。

(5)实验表明，稳定过表达MGST1可促进人肺腺癌细胞SPC-A-1的增殖，抑制人肺腺癌细胞SPC-A-1的凋亡。

由此可见，采用本发明的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，有助于研究MGST1基因功能，并且为研究MGST1基因在人肺腺癌中发病的作用机制提供了分子生物学工具。

附图说明

图1为本发明真核重组质粒的载体pcDNA3的结构示意图。

图2为电泳测试图谱。其中，