[发明专利]一种过表达MGST1基因人肺腺癌细胞的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)通过PCR(聚合酶链式反应)合成人的MGST1目的基因片段；

(2)将上述获得的MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒，其中该插入MGST1目的基因的酶切位点分别为Hind III和Kpn I。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌中进行培养，然后挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；

(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶双酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。

(4)将上一步中获得的序列正确的重组质粒pcDNA3-MGST1转染SPC-A-1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC-A-1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。

2.如权利要求1所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的MGST1目的基因片段的获取包括如下步骤：

Step1：设计MGST1过表达的引物。

Step2：通过PCR合成MGST1目的基因。

Step3：纯化回收PCR产物。

3.如权利要求2所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述的MGST1过表达的引物为

上游引物：5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGCTTCCTCCTC-3′(含Hind III限制酶切位点CCCAAGCTT)

下游引物：5′-CGGGGTACCCCTCTGCTCCCCTCCTACCT-3′(含Kpn I限制酶切位点CGGGGTACC)。

4.如权利要求2所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中还包含PCR产物鉴定过程，所述的PCR产物的鉴定方法为，PCR产物电泳后在616bp处获得扩增产物条带，且该PCR产物与用primer premier 5软件设计的目的基因片段大小基本一致。

5.如权利要求1所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述的步骤(2)包含如下步骤：

Step1：对载体pcDNA3和目的基因MGST1进行酶切反应。

Step2：回收酶切反应产物。

Step3：MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接。

Step4：用MGST1-pcDNA3转染感受态细胞。

6.如权利要求5所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述的感受态细胞为DH5α感受态细胞。

7.研究权利要求1～7中任一项所述的稳定过表达的MGST1基因细胞的验证方法，包括：Real Time QPCR和Western bolt。

8.研究权利要求1～7中任一项所述的稳定过表达的MGST1基因细胞的生物学特性的方法，，其特征在于：需要观察过表达MGST1的基因后对人肺腺癌细胞株SPC-A-1增殖情况的影响。

9.研究权利要求1～7中任一项所述的稳定过表达的MGST1基因细胞的生物学特性的方法，其特征在于：需要观察过表达MGST1的基因后对人肺腺癌细胞株SPC-A-1克隆形成能力的影响。

10.研究权利要求1～7中任一项所述的稳定过表达的MGST1基因细胞的生物学特性的方法，其特征在于：需要观察过表达MGST1的基因后对人肺腺癌细胞株SPC-A-1凋亡的影响。