[发明专利]一种用于快速检测21种点突变β地中海贫血等位基因的芯片、扩增试剂及试剂盒

说明书

本发明“一种用于快速检测21种点突变β‑地中海贫血等位基因的芯片、扩增试剂及试剂盒”，属于分子诊断技术。基于直接多重PCR、Gap‑PCR和反向点杂交相结合的检测原理，根据各基因型的突变和/或缺失位点设计相应的扩增引物和探针，以生物素标记引物，以氨基标记探针，并以基因芯片为基底，将探针固定在DNA芯片上，通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交，以信号显色盒判读来进行地贫的诊断，同时设计质控探针，更加保证结果质量与准确性。

技术领域

本发明涉及一种β地中海贫血分子检测技术，特别是涉及一种单管直接PCR(Direct PCR)检测21种点突变β地中海贫血的试剂盒，属于分子生物学医药领域。

背景技术

地中海贫血(thalassemia,简称地贫)，是是由于α或β珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成障碍，造成α链与β链的比例失去平衡，相对过剩的链呈游离状态，进而导致血红蛋白不稳定，冗余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上，容易氧化变性，红细胞膜的通透性和脆性发生改变，导致溶血性贫血，临床上常表现出症状轻重不一的慢性进行性溶血性贫血。并且根据受累的珠蛋白肽链的类型分为α、β、γ、δ和δβ地贫等类型。其中以α、β地贫最为常见，危害也最大。广泛发生于热带和亚热带国家，我国长江以南发病率高，无明显症状的携带者超过人群20％。

β珠蛋白基因簇位于人体11号染色体的短臂上，总长度约为50Kb，包括ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2个假基因。β珠蛋白肽链是由β珠蛋白基因所编码的146个氨基酸组成。β珠蛋白基因含2个内含子及3个外显子。β地中海贫血的主要分子病理学基础是β珠蛋白基因的点突变及小的插入或缺失，包括β珠蛋白基因的启动子序列突变或增强子突变都可引起β珠蛋白生成障碍性贫血。在其外显子1、外显子2、内含子1及3’端调控区集中了中国人群中发现的大部分突变。目前全世界己报道约170种左右的β珠蛋白基因的突变类型，我国己发现至少有28种此类突变，最主要的有6种CD41-42，CD17，IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中国人β地中海贫血突变基因总数的90％以上。

β地中海贫血是因调控β珠蛋白的基因缺陷而导致的β珠蛋白合成障碍的一种溶血性贫血。β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，在我国南方各省区高发，高发区人群基因携带率达到3-9％。β地中海贫血的纯合子或或β⁰β⁺的双重杂合子为致死性疾病，目前仍无较理想的治疗手段，采用基因分析法进行产前诊断，可在妊娠早期对中、重型β地中海贫血患儿做出诊断并及时终止妊娠，以避免中、重型β地中海贫血患儿出生是目前预防本病行之有效的方法。

目前对β-地贫筛查方法如血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等特异性不高，较易产生假阴性。对于α-地中海贫血的分子诊断,PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)是最早用于检测点突变的一种方法，一次只能检测一种突变，对于多个突变位点的检测操作复杂，成本高而不适合常规检测。近年发展起来的单链构象多肽性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)等，这些方法首先检测费用昂贵，且操作要求费时或不定性。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。

并且这些技术均需DNA抽提的操作繁琐复杂、耗时、易交叉污染、实验需要DNA自动提取仪精密仪器和试剂耗材成本昂贵，在临床上无法普遍推广应用。而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，并且提取与纯化DNA过程极易污染，使得实验易出现假阴性或者假阳性,极易造成漏检或误检。

另外，同时这些技术所需样本量多，对于边远地带采集的标本运输需要冷链设备，需三级包装系统，标本储存空间大；生物安全风险系数高。对全血、羊水和DBS直接检测地贫的专利技术尚无，市场上尚无此类产品。

发明内容