[发明专利]一种用于检测染色体拷贝数变异的测序文库构建方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及文库的构建方法和试剂盒，更具体地，本发明涉及用于检测染色体拷贝数变异的测序文库构建方法和试剂盒。

背景技术

研究表明，染色体数目的异常在已发现的染色体异常相关疾病中占有很大的比例(Nagaoka,et al,2012)。染色体数目的异常除了可表现为整条染色体的数目改变(染色体非整倍体)，也可表现为某染色体的某一片段的拷贝数变异(如染色体微缺失微重复综合征)。鉴于染色体异常疾病一般具有高发、危害性严重且缺乏有效的治疗手段等特点，所以利用技术手段准确检测染色体拷贝数是否存在异常具有重要的意义。

采用传统核型分析技术(Karyotyping)结合荧光原位杂交技术(FISH)或染色体微列阵分析技术(Chromosome Microarray Analysis,CMA，如aCGH和SNP-array)是目前临床上用于检测染色体拷贝数变异的主要手段和标准(Nord,et al,2015)。上世纪70年代建立起的高分辨率核型分析技术(Yunis,1978；Trask,2002)目前仍是检测染色体非整倍体、平衡或非平衡性结构重排、较大片段的缺失/重复以及嵌合体等染色体异常的金标准，但其分辨率较低(约为5Mb)，无法检出具有临床意义的染色体较小片段的拷贝数变异。而始于上世纪80年代后期的FISH技术(Trask,1991)将细胞遗传学、免疫学和分子生物学相结合，在临床研究上检测目标染色体非整倍体和结构异常等方面具有较好的应用，但是其特异性探针的设计受到对目标区域信息的限制，因而仅能够得到有限的染色体信息。近年来发展起来的染色体微阵列分析技术(CMA)则是一种高通量检测基因组DNA拷贝数变异的分子核型分析技术，其中相对成熟的比较基因组杂交(aCGH)技术和单核苷酸多态性基因芯片(SNP array)技术都属于CMA技术(Manning and Hudgins,2010)。虽然CMA技术相比于传统核型分析技术具有很高的分辨率(Breman,et al,2012)，但其在临床应用中需根据公共数据库中详尽的染色体异常及相关临床信息定制微阵列芯片，因此对某些罕见的或数据库中未涵盖的微缺失微重复(CNV)的检测存在不足。而且，目前CMA技术的难度较高和成本相对较高等特点也限制了其在欠发达地区的广泛应用。因此，为了更广泛地排查和诊断染色体疾病，需要一种在保证检测通量和分辨率的前提下能够准确检测染色体拷贝数变异的经济、简单的方法。

近些年日益成熟的高通量测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)因其通量高、准确性高、灵敏性高、自动化程度高和运行成本低等突出的优势，使其在临床研究中得到广泛的应用(Xuan,et al,2013)。目前通过NGS数据检测CNV最常用的原理是基于计算深度(read-depth)来实现的，即通过将某区段的深度与预先校正得到的理论值进行计算比较以判定该区段是否存在CNV,这种方法对于单端测序和双端测序都适用(Yoon,et al,2009；Mason-Suares,et al,2016)。在NGS文库制备的过程中通常会采用标准的PCR来扩增随机片段，而PCR不可避免的扩增偏好则会对数据的准确性造成影响(van Dijk,et al,2014；Head,et al,2014；Goodwin,et al,2016)。因此，建立一种简单的不依赖PCR的建库方法对于提高染色体非整倍性尤其是CNV的检测准确性至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服传统检测染色体拷贝数变异的方法在分辨率、全基因组覆盖程度、通量和成本等方面的不足，同时克服NGS建库过程中PCR扩增偏好性带来的问题，提供了一种不依赖PCR的检测染色体拷贝数变异的测序文库构建方法和试剂盒。采用该方法和试剂盒对待测样本进行染色体拷贝数变异检测，可实现对染色体非整倍体和染色体微缺失微重复综合征的筛查和诊断。

在第一个方面，本发明提供一种用于检测染色体拷贝数变异的测序文库构建方法，其主要包括以下步骤：

(1)利用双链DNA片段化酶将待测DNA随机片段化；

(2)对片段化后的DNA进行末端补平和3’端悬A；

(3)将末端补平并3’端悬A的DNA与测序接头连接，获得连接产物；

(4)纯化所述连接产物，获得测序文库，

其中步骤(1)-(3)在单一反应管中完成。图1示出了根据本发明的方法构建测序文库的主要步骤。