[发明专利]一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器及其制备方法

说明书

本发明公开了一种温度可控的基于辣根过氧化物酶电催化的电化学DNA传感器及其制备方法，其包括金盘热电极，巯基化单链DNA探针CP、目标DNA、标记了生物素的信号探针SP和标记了链霉亲和素的辣根过氧化氢酶。将一段巯基化的单链DNA固定在金盘热电极表面作为捕获探针CP，目标DNA一端与CP互补另一端与末端标记生物素的信号探针SP互补，形成一个三明治结构，SP上标记的生物素与耦合了辣根过氧化氢酶的链霉亲和素特异性结合，将辣根过氧化氢酶固定在电极表面，利用其催化还原过氧化氢将对苯酚氧化为对苯醌，其后在电极表面还原成对苯酚。本发明提供的检测方法对DNA的检测具有成本低廉，检测灵敏度高的特点。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体是涉及一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的制备方法及其检测DNA的方法，可以实现对DNA的高灵敏检测。

背景技术

脱氧核糖核苷酸（DNA）是生物体内遗传物质的载体，关系到生物体性状的正常表达，若DNA序列发生改变则会引起相应的疾病，因此一种快速有效对特定DNA序列的检测方法在疾病早期诊断上有着重要意义。传统的DNA检测方法主要运用一些光学方法，这些方法主要依赖大型专业仪器，同时光学方法存在灵敏度低、选择性差等缺点。相比之下，电化学分析技术是通过导线来感测待测物质信号的，具有仪器设备简单、操作方便易自动化、便于携带等优点，且其兼备灵敏度和准确度较高、选择性好等优点，因此常用于DNA检测。

辣根过氧化物酶是由铁原卟啉与糖蛋白结合而成的复合物，在自然界中的主要来源是辣根。辣根过氧化物酶性质较为稳定，具有特殊催化氧化性能。

辣根过氧化物酶是一种对温度变化十分敏感的蛋白质，当温度低于最适温度时，酶的活性较差，但当温度过高时，酶分子的结构极易发生不可逆转的变性，而导致酶的失活。以往报道的电流型DNA生物传感器，多是控制实验体系的整体温度变化，所需装置复杂，操作不易；在热电极表面直接构建酶传感器，可以只改变电极表面的温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，这样可以提高辣根过氧化物酶催化活性，使得催化反应更快更彻底的进行，从而使电极响应信号增大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种温度可控的基于辣根过氧化物酶电催化的电化学DNA传感器的制备方法及其检测目标DNA的方法。本发明的传感器结构简单、制备工艺简单、灵敏度高、检测限低、抗干扰性好。

为了实现本发明目的，本发明将一段巯基化单链DNA固定在金盘热电极表面作为捕获探针CP，目标DNA一端与CP互补另一端与末端标记生物素的信号探针SP互补，形成一个三明治结构，SP上标记的生物素与耦合了辣根过氧化氢酶的链霉亲和素特异性结合，将辣根过氧化氢酶固定在电极表面，通过调控金盘热电极温度来提高辣根过氧化物酶催化活性，实现了对目标DNA的高灵敏度检测。具体方法包括以下步骤：

（1）设计一条捕获探针DNA链CP，目标DNA链TP一端能与所述捕获探针DNA链CP互补，另一端与信号探针SP互补；CP的5’端巯基化；SP链3’端标记有生物素；捕获探针CP的DNA序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT TTTTT TTCCC ACCAA CGCTG-3’，信号探针SP的DNA序列为：5’-ATCAA TTCCA CAGTT TTCGC -3’-Biotin。

（2）将金盘电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金盘热电极。

（3）将含有捕获探针的缓冲液滴加在步骤（2）中处理好的金盘热电极上，后用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，再用牛血清蛋白对电极表面活性位点进一步封闭，得到捕获探针修饰的金盘热电极。

（4）在步骤（3）中得到的电极表面滴加5μL 含有SP和目标DNA TP的缓冲液，杂交反应结束后，将电极清洗干净。