[发明专利]一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器在检测DNA中的应用，其特征在于，检测过程如下：将上述电化学传感器与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，在通氮除氧及加入1 mM 对苯二酚和1mM过氧化氢的PBS缓冲液中进行方波伏安检测，得到响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性关系，实现对目标DNA的灵敏检测；所述PBS缓冲液浓度为0.1M，其pH为7.2～7.6；电极温度为40℃；

所述电化学DNA传感器制备方法，包括以下步骤：

（1）设计一条捕获探针DNA链CP，目标DNA链TP一端能与所述捕获探针DNA链CP互补，另一端与信号探针SP互补；CP的5’端巯基化；SP链3’端标记有生物素；捕获探针CP的DNA序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTT TTTTT TTCCC ACCAA CGCTG-3’，信号探针SP的DNA序列为：5’-ATCAA TTCCA CAGTT TTCGC -3’-Biotin；

（2）将金盘电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金盘热电极；

（3）将含有捕获探针CP的缓冲液滴加在步骤（2）中处理好的金盘热电极上，后用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，再用牛血清蛋白对电极表面活性位点进一步封闭，得到捕获探针修饰的金盘热电极；

（4）在步骤（3）中得到的电极表面滴加5μL 含有SP和目标DNA TP的缓冲液，杂交反应结束后，将电极清洗干净；

（5）将步骤（4）中得到的电极浸泡在牛血清蛋白溶液中一定时间，再将电极浸泡在标记了链霉亲和素的辣根过氧化物酶溶液中，反应结束后得到电化学传感器；

步骤（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s，干燥为氮气吹干；

步骤（3）中，所述缓冲液为含有10～20 mM Tris-HCl，800～1000 mM NaCl， 9～11 mM三（2-羧乙基）膦的混合液，其pH为7.2～7.6。

2.根据权利要求1所述的一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的应用，其特征在于，步骤（3）中，捕获探针CP的3’端标记了生物素，浓度为1～2μM；修饰温度为20～25℃；修饰时间为1.5～2.5h。

3.根据权利要求1所述的一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的应用，其特征在于，步骤（3）中，巯基己醇浓度为0.1～4mM，电极浸入时间为1h；牛血清蛋白浓度为0.1～2%，电极浸入时间为1h。

4.根据权利要求1所述的一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的应用，其特征在于，步骤（4）中，SP的浓度为50～100nM；修饰温度为35℃～37℃；修饰时间为1.5～2.5h。

5.如权利要求1所述的一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的应用，其特征在于，步骤（4）中，缓冲液为含有10～20 mM Tris-HCl，800～1000mM NaCl的混合液，其pH为7.2～7.6。

6.如权利要求1所述的一种温度可控基于酶催化的电化学DNA传感器的应用，其特征在于，步骤（5）中，牛血清蛋白的浓度为0.1～2%，电极浸入时间为1h；标记了链霉亲和素的辣根过氧化物酶浓度为8～12 μg/ml，反应温度20～25℃，反应时间为0.2～1h。