[发明专利]一种菜豆环氧化物水解酶及其异源表达方法在审
| 申请号： | 201710474196.1 | 申请日： | 2017-06-21 |
| 公开（公告）号： | CN107177569A | 公开（公告）日： | 2017-09-19 |
| 发明（设计）人： | 邬敏辰;石小玲;阚婷婷;李闯;李剑芳 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N9/14 | 分类号： | C12N9/14;C12N15/55;C12N1/21;C12P41/00;C12P17/02;C12R1/19 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 菜豆 环氧化物 水解 及其 表达 方法 | ||
【说明书】：
技术领域
本发明涉及一种菜豆环氧化物水解酶及其异源表达方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
手性环氧化物及其水解产物邻二醇可用于合成手性药物中间体等物质，在医药等领域可发挥重要作用。两个不同构型的物质，有时一个可发挥药理作用的同时，另一个构型会产生毒害作用，如沙利度胺的(R)-对映体有镇静作用，可治疗妇女妊娠反应，但(S)-对映体及其代谢产物有严重的胚胎毒性和致畸作用。因此用于合成手性药物中间体的物质最好以光学异构体的形式应用。
手性纯环氧化物及邻位二醇可通过化学法和生物法获得，化学法主要可分为不对称合成法、选择吸附拆分法、结晶拆分法、化学拆分法、动力学拆分法和色谱分离法，但都对催化的底物类型要求严格、并且反应过程中易造成环境污染，不符合绿色环保的生产理念；相比于化学法，生物法更加高效专一，并且反应条件温和、绿色、经济，因此逐渐受到重视。生物法中，获得环氧化物及邻二醇的生物法主要有直接加氧途径、间接环氧化途径和酶解拆分合成途径。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase，EHs)和酯酶均可参与到酶解拆分途径中，但环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)不像酯酶对催化的底物类型有限制。
EHs来源广泛，在小鼠、土豆、黑曲霉(Aspergillus niger)等动、植物和微生物中均有发现，因其可通过调节环氧化物在生物体内的含量水平而起到调节新陈代谢、解毒、调节信号分子等作用，因此长期以来EHs多被用于生理及生化研究。直到从微生物来源中发现EHs的存在，才使得其在有机合成中的应用逐渐受到重视。理想EHs可通过动力学拆分或归一性水解的途径得到手性纯环氧化物或邻二醇，但是在实际催化过程中，由于EHs的性质并不理想，使得得到的环氧化物或邻二醇的光学纯度没有达到应用要求，并且选择性EHs动力学拆分时往往只关注提高保留的环氧化物的光学纯度，使得水解产物邻二醇的光学纯度因为不理想而无法应用，造成邻二醇的浪费。因此仍需挖掘新型EHs，以期应用于手性中间体的合成，手性拆分环氧化物的同时，也得到手性纯邻二醇，从而实现工业化的生产。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种菜豆(Phaseolus vulgaris)来源的新型环氧化物水解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供表达所述环氧化物水解酶的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以pET-28a(+)为载体，在大肠杆菌中表达SEQ ID NO,1所示的环氧化物水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10或E.coli JM109。
本发明的第四个目的是提供所述环氧化物水解酶的应用，是将SEQ ID NO.2所示的环氧化物水解酶用于外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)的生物转化。
在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶为酶液、酶粉或负载环氧化物水解酶的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌按1～2g湿菌体/6～8mmol底物的添加量添加至含rac-SO的缓冲液中，于22～28℃反应4～18h。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌按1g湿菌体/6mmol底物的添加量添加至含rac-SO的缓冲液中，于22～28℃反应4～18h。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为0.05～0.15mol/L，pH 7.0～7.2的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述反应过程中还以200～220r/min搅拌。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌以1g湿菌体/5mL磷酸缓冲液(K2HPO4-KH2PO4,0.1M/L,pH 7.0)的浓度悬浮后，添加6mM rac-SO进行水解，于25℃、220r/min反应。
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- 2015-07-30 - 2018-08-24 - C12N9/14
- 本发明公开一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法，环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多点突变获得。制备方法：将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)‑EH；采用滚环PCR扩增质粒pET28a(+)‑EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明环氧化物水解酶具有极高的温度稳定性和pH值适应范围，可以大大提高工业化生产中环氧化物水解酶的使用寿命。
- 一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因-201510181731.5
- 丁俊美;于婷婷;黄遵锡;李俊俊;慕跃林;杨云娟 - 云南师范大学
- 2015-04-15 - 2018-07-06 - C12N9/14
- 本发明公开了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其氨基酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。本发明还公开了编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1可用于7‑ACA的脱乙酰化。
- 具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸-201680043075.5
- P·V·哈里斯;S·哈萨尼;F·刘 - 诺维信股份有限公司
- 2016-07-22 - 2018-06-08 - C12N9/14
- 本发明涉及具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性、催化结构域、碳水化合物结合模块的分离的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域或碳水化合物结合模块的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域或碳水化合物结合模块的方法。
- 一种人的三磷酸腺苷酶家族蛋白2突变蛋白及其应用-201711221214.1
- 张耀洲;吴玉乾;冯建华;李冬梅;张树军;胖铁良;陈玉皎;王文雅 - 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司
- 2017-11-29 - 2018-06-01 - C12N9/14
- 本发明涉及一种人的三磷酸腺苷酶家族蛋白2突变蛋白及其应用，将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并进行分析，确定出人的三磷酸腺苷酶家族蛋白2的突变蛋白，根据该人的三磷酸腺苷酶家族蛋白2突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为人体癌症的基因诊断提供的指引作用，实现癌症的早诊断、早发现和相关治疗。
- 一种脱卤酶DhmB及其编码基因与应用-201510119494.X
- 董志扬;董亮;戴欣;张山;王丽;张岩峰 - 中国科学院微生物研究所;中国大洋矿产资源研究开发协会
- 2015-03-18 - 2017-11-28 - C12N9/14
- 本发明公开了一种脱卤酶DhmB及其编码基因与应用。本发明的脱卤酶DhmB是如下a)或b)的蛋白质a)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与脱卤相关的蛋白质。本发明的脱卤酶DhmB易纯化、稳定性好、耐受中高温、最适温度65℃、耐受有机溶剂且能降解低碳链的有机卤素化合物、经典农药及化学毒剂等，具有广阔的工业应用前景。
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