[发明专利]纯化白喉毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，涉及纯化白喉毒素的方法。

背景技术

白喉是由白喉棒状杆菌(以下简称白喉杆菌)引起的急性呼吸道传染病。人是白喉杆菌的唯一天然宿主，白喉仅通过飞沫和密切接触传播。白喉毒素可以引起产生上呼吸道阻塞性假膜(哮吼)或损伤心肌及其他组织，从而致病和致死。按其菌落形态的不同及对淀粉发酵的特点，白喉杆菌可分为4个生物型(重型、belfanti、轻型和中间型)[Funke G,von Graevenitz A,Clarridge JE,Bernard KA.Clinical microbiology of coryneform bacteria.Clin Microbiol Rev 10:125-159,1997]。除细菌外毒素外，细胞壁成份如O和K抗原，在白喉的致病性中均具有重要作用。所有棒状菌属的热稳定性O抗原都相同，而热不稳定K抗原，则因菌株不同而有差异，因而可用于鉴别菌株。同时，K抗原对于粘膜吸附很重要，侵袭性是由索状因子(毒性糖脂)介导的。白喉杆菌最重要的毒力因子是外毒素，外毒素是由噬菌体介导、细菌染色体编码的高度保守性多肽。在宿主细胞外，外毒素的活性很低，但通过非毒性片段B粘附并进入细胞后，毒性片段A解离，通过抑制细胞蛋白合成杀死细胞。白喉外毒素可引起局部和全身细胞死亡[Diphtheria vaccine:WHO position paper.Geneva,World Health Organization,2006,81:24–32]。据估计在20世纪80年代大量使用白喉类毒素以前，在发展中国家每年约有100万病例，5万～6万例死亡。即使在近几年，在地方性流行区，白喉的报告病死率仍超过10％。

对于白喉疾病，最可靠的预防方法是注射白喉类毒素疫苗。通过疫苗的注射，人体内产生了抗体，并在较长时间内保持一定的浓度，可以中和进入体内的毒素，不致发病。

目前国内上市生产企业均采用硫酸铵二段盐析法纯化白喉毒素。盐析法是蛋白质纯化中一种较为粗糙的纯化方法，原理是在蛋白质溶液中加入中性盐，改变蛋白质的水化膜及表面电荷，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。实际上就是利用蛋白质溶解度的差异进行分离。其优点是成本低，且不会引起蛋白质变性；缺点是纯度低，注射后易产生不良反应，安全性有待提高。白喉类毒素的不良反应大多与培养基中的未完全水解蛋白有关，一般是由白喉毒素纯化后残留的未完全水解蛋白的致敏作用造成的。这些培养基中的非有效成分经甲醛脱毒后交联在白喉类毒素上，具有反应原性，从而引起变态反应。

因此，我们需要采用更有效的纯化手段，进一步提高白喉毒素的纯度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，利用离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的特点，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，采用离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素粗品，获得高纯度的白喉毒素。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

层析技术是分析领域一种常用的技术。其中，疏水层析是利用盐—水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间的疏水力不同，而使样品组分得以分离的一种层析方法。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质进行分离的。利用此种性质，因蛋白质疏水性不同，可以逐个地先后被洗脱而纯化。该方法可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。而离子交换层析是以离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。发明人将离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素，充分利用了离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的性质，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，获得高纯度的白喉毒素，并有效地避免了白喉毒素引起的变态反应。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化白喉毒素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)对含有白喉毒素的溶液进行粗提，以便得到白喉毒素粗品；(2)将所述白喉毒素粗品进行浓缩，以便得到浓缩后的粗品；(3)调节所述浓缩后的粗品的pH值至中性或碱性，以便得到调节pH后的粗品；(4)将所述调节pH后的粗品分别进行疏水层析和离子交换层析，以便获得纯化后的白喉毒素。

发明人发现，将离子交换层析和疏水层析相结合纯化获得的高纯度白喉毒素，可有效减少过敏原，减轻注射后的不良反应。

另外，根据本发明上述实施例的纯化白喉毒素的方法，还可以具有如下附加的技术特征：