[发明专利]一种基于定量PCR技术的GSTT1分型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体是一种基于定量PCR技术的GSTT1分型检测方法。

背景技术

GSTT1为一种重要的代谢酶，参与对内生和外源性物质的转化和代谢，赋予代谢物新的生物学特性。在人类GSTT1具有多态性，GSTT1缺失为一种常见的基因型。不同GSTT1基因型的个体地物质的转化功能存在差异。GSTT1基因分型用于多种生物学性状的研究。传统的，由于GSTT1缺失多态性可以通过普通PCR检测，多采用常规基因特异性PCR，琼脂糖电泳检测方式确认GSTT1基因型。虽然简便，但是由于电泳操作必须开管加样和电泳，容易造成实验室污染，难于在高通量下确保实验可靠性。同时常规PCR电泳分析法也难于发现杂合子基因型，影响基因性状分析的准确定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种避免有毒DNA染色剂污染、提高检测通量的基于定量PCR技术的GSTT1分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于定量PCR技术的GSTT1分型检测方法，具体步骤如下：

（1）采用二代测序验证的人GSTT1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组DNA作为相应对照物；

（2）采用GSTT1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增GSTT1基因片段，同时在GSTT1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计GSTT1基因特异性TAQman探针SEQ3-Fam；若存在GSTT1基因，则GSTT1基因特异性TAQman探针SEQ3-Fam释放FAM荧光信号而被定量PCR仪器检到；若没有GSTT1片段，则无GSTT1扩增，无FAM荧光信号释放；

（3）采用ALbumin特异性的PCR引物SEQ4和SEQ5扩增ALbumin基因片段，同时在ALbumin基因特异性的引物界定的扩增区域内设计ALbumin基因特异性TAQman探针SEQ6-Vic；若存在合格样本，则有ALbumin扩增，释放Vic荧光信号，定量PCR仪器检测到Vic荧光信号；若样本不合格，则样本无ALbumin扩增，无Vic荧光信号释放；

（4）对比扩增FAM/VIC信号确认待检测样本基因型；

所述引物SEQ1的核苷酸序列号如下：TCTGTGGTCCCCAAATCAGA；

所述引物SEQ2的核苷酸序列号如下：CTGTGGGGAAAAGGGTACAG；

所述GSTT1基因特异性TAQman探针SEQ3-Fam的核苷酸序列号如下：

Vic-5´-TGCTGCCCATCCCTGCCCTCACAACCA；

所述引物SEQ4的核苷酸序列号如下：5´-ACTCCAAACCTGATGCTTCT-3´；

所述引物SEQ5的核苷酸序列号如下：5´-CCTTAGGGCAGAATTATCCA-3´；

所述ALbumin基因特异性TAQman探针SEQ6-Vic的核苷酸序列号如下：

FAM-5´-CAGCCTGTTGCCCCTTTTAGAGTTCCTTTT-3´。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤（1）中人GSTT1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组DNA的浓度为10ng/μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用基于TAQman探针的定量PCR实现闭管一次检测确定GSTT1基因拷贝数的目的，解决了常规GSTT1检测需要PCR后开管电泳，而容易引起实验室内PCR产物污染，难于高通量稳定获得准确基因分型结果的问题，同时简化了PCR检测方法，防止电泳检测方法的操作过程复杂、存在潜在DNA染料等环境污染危险以及人为结果误判的可能；可以有效预防PCR产物污染，避免有毒DNA染色剂污染，可以大大简化检测与结果分析过程，提高检测通量；另外，本发明也建立一种定量机制，提供鉴定发现杂合子的技术路线。

附图说明

图1为本发明实施例中ALbumin基因扩增和GSTT1特异性片段扩增曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1，一种基于定量PCR技术的GSTT1分型检测方法，具体步骤如下：

（1）采用二代测序验证的浓度为10ng/μl的人GSTT1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组DNA作为相应对照物；