[发明专利]可参与生物合成转化后修饰的葡糖基转移酶基因

说明书

本发明发现了一种葡糖基转移酶，可用于黄酮类和聚酮类化合物的糖基化修饰，从而实现化合物的定向生物转化，获得有别于这些天然产物结构的新型活性化合物。

技术领域：

本发明涉及一个可参与黄酮类，聚酮类化合物合成后修饰的糖基化酶基因及其在生物转化和合成生物学中的应用。

背景技术：

真菌生物转化是利用细胞内特定的酶对外源化合物进行结构修饰与改造，从而获得更有价值的代谢反应。白僵菌属真菌通过各种代谢方式转化不同结构类型的化合物，在要药物研究领域占有重要地位。球孢白僵菌中含有大量的糖基转移酶、细胞色素P450、脱氢酶、脱羧酶和酰基转移酶等修饰酶基因，具有多种转化功能，其中最独特功能为糖基化作用，目前已经被用于300多种不同底物的生物转化。

糖基转移酶(GT)在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，糖基化的产物具有很多生物学功能。在不同的GT家族中存在一类与抗生素生物合成相关的GT，它的功能是在抗生素等生物活性物质的生物合成后期使其糖基化，通过糖的位置、类型和数量的改变对抗生素的活性进行调节。目前，我们在实验室筛选的球孢白僵菌中发现了此家族中的葡糖基转移酶，通过异源表达可修饰黄酮醇，黄烷醇、二氢黄酮、异黄酮类和查尔酮在内的黄酮类及其衍生化合物、苯二酚内酯等聚酮类化合物，表现出高效的催化效率以及广泛的底物识别能力。这一点使其在组合生物合成中能得到灵活的应用，为先导化合物的发现及药物的定向转化提供了新的研究方法与途径。

目前虽然已发现球孢白僵菌对天然产物具有生物转化的功能，但还未发现任何参与天然产物合成后修饰的相关基因，只能利用菌体进行生物法转化，转化效率低，产物不单一，无法实现定向转化。球孢白僵菌的生物转化以糖基化为为主，发现球孢白僵菌中参与合成后修饰的糖基转移酶有利于拓展活性化合物的化学空间，提高化合物结构的多样性，为发现和改造新活性的天然产物奠定基础。

发明内容:

本发明的目的是，获得可参与化合物生物转化的葡糖基转移酶基因，利用该基因实现某些化合物体外的糖基化修饰，增强其活性。

本发明通过人工合成，获得了葡糖基转移酶基因，命名为BbUGT86，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

构建了可在酵母BJ5464中表达的重组质粒，并在酵母中进行异源表达转化。

将所得的蛋白产物分别与不同的聚酮类或黄酮类化合物进行作用，得到了原化合物结构中连接有葡萄糖基的糖基化产物。

通过一系列的生理生化实验，发现这些原先极性较低而不适于药用的化合物在糖基化修饰之后较未修饰前水溶性增强，有利于改善其油水分配系数。

具体如下：

1、获得BbUGT86基因

通过基因组测序和相关预测软件对糖基转移酶进行结构分析，设计引物，由cDNA扩增获得一种新的葡糖基转移酶基因BbUGT86，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、葡糖基转移酶BbUGT86酵母表达载体构建与酵母转化

将含有完整的BbUGT86的DNA片段连接到PRS425m载体上，构建了组成型表达质粒PRS425m-BbUGT86，转入营养缺陷型酵母受体BJ5464中进行异源表达。

3、重组子的筛选

将表达载体PRS425m-BbUGT86转入不能合成亮氨酸缺失的酵母菌中，利用亮氨酸营养缺陷型标记筛选重组子。

4、聚酮类化合物饲喂转化试验及转化产物分析

在上述重组菌株培养过程中，添加化合物1进行作用。然后用有机溶剂提取，将提取物进行HPLC液相、二级质谱和核磁共振分析，确证产物结构。所述化合物1是苯二酚内酯类聚酮(Desmethyl-Lasiodiplodin)。