[发明专利]一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法

权利要求书

1.一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于：通过编码伪狂犬病毒糖蛋白gH中碱基序列得到两对检测引物，将待测样本提取DNA得到样本DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两次PCR扩增，每次PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测伪狂犬病毒。

2.根据权利要求1所述的一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述两对检测引物，分别为外侧引物PRV-O-F、PRV-O-R和内侧引物PRV-I-F、PRV-I-R；所述外侧引物对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端与UL21基因区间；所述内侧引物在外侧引物扩增序列内侧、且对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端。

3.根据权利要求1或2所述的一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)编码得到所述外侧引物序列为：

PRV-O-F：上游引物5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’

PRV-O-R：下游引物5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’

编码得到所述内侧引物序列为：

PRV-I-F：上游引物5’-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3’

PRV-I-R：下游引物5’-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3’

2)提取样品DNA

采集猪血样，收集样本血清，用柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA得到样品DNA；

3)PCR扩增与电泳检测

A：用外侧检测引物PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为：Premix Taq 12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5μL，ddH₂O8-9μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s,55-60℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸8-12min，2-5℃10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；

B：用内侧检测引物PRV-I-F、PRV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增，PCR反应体系为：Premix Taq 12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5μL，ddH₂O8-9μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s,55-65℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸8-12min，2-5℃10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；

其中，所述外侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述内侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段。