[发明专利]一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒

说明书

本发明公开了一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，其涉及生物技术领域。本发明用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体，试剂盒用于检测具有致病性的特异性抗供者抗体。本发明是将器官受者的血清加入与供者组织相容抗原相同的血管内皮细胞培养物内，在摄氏温度35℃‑37℃下培育后测定血管内皮细胞的反应。试验结果揭示了器官移植受者与供者之间高度特异且精准的相互作用，为早期发现器官排异反应并制定早期治疗方案提供了病理学依据。不需活检材料，为临床医师提供了一种定期监视接受器官移植病人的有力、有效且十分经济的手段。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体。

背景技术

外科移植是目前根治器官衰竭最有效的途径，它不但需要严格广泛的医疗护理，还要求器官供者和受者之间的人类组织相容抗原相同以避免受者的免疫系统攻击外来的组织。如果二者的人类组织相容抗原类型不同，受者体内天然存在或诱导合成的抗体将攻击移植的器官组织。然而，在临床实践中，器官供者和资源十分限制，供者和受者之间的抗原相同程度变异相当巨大。据报道，8－25％的接受器官移植的病人都会产生针对供者特异的抗体即DSA,其中50％的病人在五年内将出现抗体介导的排斥反应并最终导致器官移植失败。

然而，不是所有的DSA都能介导排斥反应。虽然DSA的某些特性包括亚型、滴度、特异性、结合力及克隆性与致病性有密切关系，但是目前尚无试验手段直接观察DSA与供者血管细胞的相互作用。这是鉴定DSA的致病性的关键步骤；DSA与供者细胞的相互作用才是决定器官在受者体内生存时间的决定性因素。

迄今为止，LUMINEX公司生产的单抗原微球是临床上检测DSA最常用的方法。它评估的原理是在每个微球上均包被不同的人类白细胞组织相容抗原，它们可特异性地结合病人血内的DSA，从而确定它们的种类和强度。虽然单抗原微球法可以提供DSA在免疫学上的特性，但是，它不能完全确立DSA在介导细胞功能方面的作用。这在一定程度上限制了它在指导临床医师决策的应有的价值。

C1q单抗原球检测法是在临床中使用的鉴定致病性DSA的试验。C1q受抗体活化并启动经典补体激活途径，其产物C4d沉积在组织中导致细胞毒性溶解，造成移植的器官功能丧失。迄今为止，大量科学研究与临床结果认为补体激活是急性排斥反应的主要途径，而慢性排斥反应与非补体途径的激活更相关。

抗体介导的排斥反应是一个极为复杂包含众多机制的过程。具有致病性的DSA不但要与血管内皮细胞表面的人类白细胞组织相容抗原紧密结合，而且能进一步触发细胞内的信号传导通路，才会造成内皮细胞激活。持续激活的内皮细胞一方面加速释放炎性因子，另一方面在细胞表面增加粘附蛋白。这些反应的综合结果是在毛细血管周围侵润大量炎性细胞和细胞增殖，进一步发展为血管阻塞，组织坏死。由此可见，精准评估DSA的致病性必须依赖于DSA与血管内皮细胞的相互作用。

综上所述，慢性抗体介导的排斥反应是当今器官移植医学首要解决的问题，它不仅增加了病人的经济负担，而且令移植的器官在体内不能发挥予期的功能。本发明建立了洞察DSA与血管内皮细胞相互作用的检测手段；它可特异地，准确地确定DSA的致病性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是解决功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒。

所述再构细胞板的血管内皮细胞培养物均具有确定的人类白细胞组织相容抗原谱。确定抗原的方法是提取血管内皮细胞培养物DNA，使用微量聚合酶链式反应试剂盒，美国One Lamda产品，将人类白细胞组织相容抗原分类为：HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，和HLA－DP。将所获得的细胞抗原的信息储存在数据库内；确定抗原的细胞冻存在液氮中备用。