[发明专利]一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒

权利要求书

1.一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性对照血清、阴性对照血清、阳性标准品、空白试剂、再构细胞板、培养液、汉氏磷酸缓冲液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、羊抗ICAM-1抗体、抗羊FITC标记抗体、白蛋白溶液；其中，所述的阳性标准品、培养液、羊血清/磷酸缓冲液、聚甲醛、白蛋白溶液的组分及配比如下：

阳性标准品：0.1ng/mL肿瘤坏死因子－A；

培养液：EGM-2培养液，EGM-2培养液内含HAM’氏12培基、生长因子添加物；

羊血清/磷酸缓冲液：体积比10％；

聚甲醛：体积比4％；

白蛋白溶液：重量比1％；

所述方法的步骤如下：

(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应的人类白细胞组织相容抗原的血管内皮细胞；

(2)将所述血管内皮细胞种植在96-孔细胞培养微孔板的底部，每孔含3000-4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；

(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；

(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；

(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；

(6)准备试剂盒；

(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。

2.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：使用了与供者的人类白细胞组织相容抗原表达相同的血管内皮细胞培养物，血管内皮细胞培养物与病人血清的相互作用是特异的。

3.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：所述再构细胞板的细胞为高度选择性血管内皮细胞；当医师申请使用此诊断试剂的同时，应提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP；依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部；所述试剂盒内的再构细胞板的设计是依据供者的人类白细胞组织相容抗原的类型而为受者制定的，因而有高度的选择性。

4.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：血管内皮细胞表达的人类白细胞组织相容抗原与接受器官移植的病人DSA抗体相对应。

5.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：所述方法步骤(3)中所述条件为摄氏温度35℃－37℃、二氧化碳分压为4％－5％。

6.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：所述方法步骤(3)中所述病人血清和血管内皮细胞的反应时间是24小时。

7.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：人类白细胞组织相容抗原的测定使用低分辨分型方法。

8.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异方法的试剂盒，其特征在于：所述血管内皮细胞来自人的新鲜标本，为血管片段、脂肪、肌肉、皮肤、脐带、肝、肺、肾中的一种。