[发明专利]一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及发光细菌的综合毒性检测方法领域，具体涉及一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法。

背景技术

土壤作为人类赖以生存的场所，含有多种污染物，如持久性有机污染物与农药、挥发性有机物和多环芳烃类有机物等。每种污染物不仅有各自的毒性，而且各种污染物质混合、相互作用也会产生潜在的毒性。现有检测技术多局限于检测单一污染物毒性，无法测定污染物的复合污染效应。因此，开展土壤的综合毒性检测工作有重要意义。

我国是农业大国，建立准确可靠、灵敏度高和符合国际标准的农田土壤污染物检测技术，从整体上提高我国农业产地环境中污染物综合毒性检测能力，为我国农产品的种植以及农田土壤的修复提供重要的理论依据以及指导意见，保证农产品的质量安全和避免国际间的贸易争端，具有非常重要的理论和实践意义。

现有检测土壤毒性的技术可以分为定量检测技术和综合毒性快速检测技术。这些方法都可以检测土壤综合毒性，有些方法通过同时检测土壤中多种农药、重金属等的含量反映土壤综合毒性，如色谱类技术、化学发光法、比色法、免疫色谱法等；有些则通过多种农药、重金属等的联合作用效果反映饮用水综合毒性，如微生物法和酶法。目前，有机磷农药的定量检测技术主要是色谱类技术，包括气相色谱法液相色谱法、超临界流体色谱法等。重金属定量检测技术包括紫外可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子荧光光度法、电感耦合等离子体质谱法等。以上这些方法都需要昂贵的检测仪器和复杂的前处理，并且由于仪器测定条件变化与检测结果密切相关，需要非常专业的分析测试人员操作。因此，只有专业分析测试机构和研究机构的中心实验室才具备测试条件，检测样品的周期相对较长，检测过程复杂，检测成本较高，不适合抽检实践中快速和简便的需要。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术中存在操作复杂、时间长、检测成本较高，并且局限于检测单一污染物毒性，无法测定污染物的复合污染效应等问题，本发明提供一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，通过甲醇/乙二醇溶液浸提方法对土壤样品中的非水溶性有毒物质进行浸提，利用发光细菌法一明亮发光杆菌T₃对有毒有害物质的灵敏性和较低的检测限，建立一种简便的土壤综合毒性检测方法，降低了对采样量的要求，从而能够开展土壤样品进行综合毒性的快速检测，测定土壤的综合毒性水平。

技术方案：一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一.对土壤样品进行预处理：在待检测土壤区域中采用随机多点取样法选取采样点，采集耕层土壤内的土样后，将土样混合均匀，置于土壤袋后在室温下阴凉处风干，去除植物残根，磨碎后于室温避光保存备用；

步骤二.样品的浸提：称取步骤一制备的土样，过尼龙筛后用甲醇索氏提取，减压旋转蒸发浓缩，加入乙二醇后将该混合物继续浓缩备用；

步骤三.浸提液的毒性检测：取培养后的发光细菌培养液，加入步骤二制备的样品浸提液、15wt.％NaCl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度；

步骤四.样品毒性的表达：测量步骤三静置后混合液的发光抑制率、氯化汞当量浓度。

作为优选，所述步骤一选取5个采样点。

作为优选，所述步骤二中称取3～5g步骤一制备的土样，过2mm尼龙筛后用甲醇索氏提取16h，减压旋转蒸发浓缩至5mL，加入3～5mL乙二醇，然后将混合物继续浓缩至5mL备用。

作为优选，所述步骤三中发光细菌为明亮发光杆菌T₃。

作为优选，所述步骤三培养后的发光细菌培养液、样品浸提液、15wt.％NaCl溶液和纯净水的体积比为1：2：4：13。

作为优选，所述步骤三取50μL培养后的发光细菌培养液，加入100μL样品浸提液、200μL 15wt.％NaCl和650μL纯净水。

作为优选，所述步骤三中培养后的发光细菌培养液的制备过程如下：取培养基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、NaCl 3g、Na₂HPO₄ 0.5g、KH₂PO₄ 0.5g和蒸馏水100mL混合均匀，调节p H值至6.5～7.0；第一代斜面菌种在20℃温度下培养24h后，立即接入第二代斜面培养12h后备用；将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有50mL培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度。

作为优选，所述步骤三中取培养16～18h后的发光细菌培养液。