[发明专利]一种优化的基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系

说明书

本发明公开了一种优化的基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系，即在病毒衣壳蛋白编码基因与负责跨膜、转运和锚定的冰核蛋白N端结构域的编码基因inaQn中间插入一段接头蛋白的编码基因，验证后构建诱导型表面展示病毒衣壳蛋白的重组质粒；转化宿主菌，获得升级版衣壳蛋白的细菌细胞表面展示系统；经诱导表达，使病毒衣壳蛋白展示在大肠杆菌细胞表面，得到优化的病毒受体捕获体系。相较于传统病毒受体的纯化和分析方法，该表面展示系统具有试剂成本低、操作简单、实验周期短、对实验设备要求低、易于分离病毒受体和降低背景干扰等优点。升级版病毒受体捕获体系为高效发掘病毒新受体奠定了坚实基础，同时也提供了一种蛋白纯化与浓缩的新思路。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及目标物捕获体系，尤其涉及一种优化的基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系，目标物如病毒受体或特异性吸附配体等。

背景技术

分析和鉴定病毒受体是探索研究病毒入侵细胞和宿主感染机制的关键步骤。目前，病毒受体分析主要依赖于免疫共沉淀方法和DNA介导的转化；再以体外培养并富集的大量病毒颗粒对病毒受体进行验证；最后，获得病毒受体的组分和结构。但是，很多病毒暂无成熟的体外增殖体系，这些方法不具有实际操作性。即，缺少病毒吸附介质的分离体系是阻碍深入研究病毒与宿主互作的主要瓶颈。因此，如何大量获得易于后期试验操作的病毒替代物，成为解析不可体外培养的病毒的受体的关键。以下以人源诺如病毒(Humannoroviruses，HuNoVs)为例展开描述。

在杆状病毒体系中，外源表达的HuNoVs VP1蛋白可以自动折叠并形成类病毒粒子(virus-like particles，VLPs)；在原核表达体系中，只有P结构域的外源表达产物可以折叠成24个单位的P颗粒(P particles)；VLPs和P颗粒具有良好的免疫原性和与已知受体(如：组织血型抗原(histo-blood group antigens，HBGAs))结合的特性，常被用于研究HuNoVs与载体互作的替代物。但是，两者的表达系统操作繁琐且难以从复杂体系中分离获得病毒衣壳蛋白与受体(吸附介质)的复合物。为了克服上述技术瓶颈，目前的研发技术通过建立细菌细胞表面展示系统来构建约百倍放大的假HuNoVs。

细菌细胞表面展示系统是指通过脱氧核糖核酸重组技术，将某外源蛋白的编码基因与可锚定于受体细菌表面的编码基因进行融合，通过融合蛋白在宿主细胞中表达、分泌，最终将融合蛋白跨膜锚定在宿主细胞的表面，达到研究融合蛋白功能或对融合蛋白进行应用的目的。冰晶核蛋白(ice-nucleation protein，INP)可通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面展示。INP的N端结构域(InaQN)也具有完整INP的表面展示功能。锚定于细胞表面的外源蛋白可以克服融合蛋白在胞内无法正确折叠等弊端。研究发现：假HuNoVs的承载体(大肠杆菌)会严重干扰病毒受体的分析。因此，需要开发优化的假HuNoVs，用来构建新的细菌表面展示系统。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种优化的基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系。

发明内容

发明人前期已经通过构建重组表达质粒pET28a-inaQn-P(GII.4)建立了一种基于细菌细胞表面展示系统的病毒受体捕获体系，前期的发明内容由于应用中病毒受体(介质)分析容易受到所展示病毒衣壳蛋白承载体(大肠杆菌)的背景干扰，影响分析结果。本发明所要解决的技术问题是降低背景干扰，提高吸附效率并提供一种基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系，在原有病毒受体捕获体系的基础上，通过简单的诱导使病毒衣壳蛋白高效表达并锚定于宿主细菌的细胞表面，通过加入可被蛋白酶识别且作用的接头蛋白，降低背景干扰、提升目标物分离效率，从而应用于病毒受体的捕获、富集和分析，以及目标外源蛋白的分离纯化。

为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种基于优化的细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系，该目标物捕获体系包括能锚定在宿主菌细胞表面的冰核蛋白N端结构域，与冰核蛋白N端结构域相连的接头蛋白，以及与接头蛋白相连的病毒的衣壳蛋白。