[发明专利]一种采用载体吸附进行黑曲霉孢子增殖及其干孢子粉的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多孔载体吸附黑曲霉孢子增殖的方法以及一种黑曲霉孢子粉的干燥复合保护剂及干燥方法。

背景技术

在工业发酵领域，菌种的扩大培养是发酵工艺的重要环节。黑曲霉是极其重要的工业微生物，是许多发酵产品的生产菌，特别是有机酸、酶制剂、抗生素等行业，用来生产柠檬酸、苹果酸、没食子酸、衣康酸、苹果酸等有机酸，还可以用于生产糖化酶、酸性蛋白酶和果胶酶等30种以上的酶制剂，仅我国标准规定的黑曲霉来源的食品用酶制剂就有26种之多。黑曲霉还可用于禽畜的粪便、有机垃圾、生物肥料、秸秆腐熟等发酵时添加。

应用黑曲霉生产各类产品过程中，主要以黑曲霉孢子进行接种发酵。因为黑曲霉孢子具有易贮藏、保藏费用低、可便于运输、不易污染、环境适应性强、直接投入发酵、发酵再生能力强等优势。在实际生产中一般将黑曲霉菌孢子接种于待发酵物料，因此研制黑曲霉孢子粉具有较好的生产应用价值。

黑曲霉柠檬酸深层发酵，需要用大量的黑曲霉孢子接种，工业上一般利用2L的三角瓶采用静置扣瓶法固体发酵制备的麸曲孢子。由于孢子增殖时间较长，麸曲皮的营养不足够支撑孢子的萌发增殖的这个过程，导致产生的黑曲霉孢子的质量不高且易退化。而且在孢子增殖过程中需要大量氧气，麸曲瓶静置培养造成供氧不足，产生的孢子质量不稳定，并且每瓶最多收获孢子数量仅在10¹¹CFU/瓶，导致50吨种子罐需要接种100-110瓶，为大规模工业化生产带来沉重负担。所以需对孢子增殖方式进行优化，以得到高数量、高质量的黑曲霉孢子进行接种发酵。

干燥工艺是制备微生态制剂的关键，菌体存活率及活性是确定菌体最佳干燥工艺和最佳保护剂配方的指标。干燥对微生物细胞的影响主要是对细胞膜和敏感蛋白质的损伤。干燥过程中会造成细胞膜通透性改变、膜的性质、结构和功能改变、蛋白质变性失活、pH的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等。

研究表明，在干燥前加入适当的保护剂可以改变菌体干燥时的物理、化学环境，减轻或防止干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特征和生物活性，从而提高微生物干燥过程中的存活率，延长菌种贮存期。目前广泛采用的保护剂有海藻糖、脱脂奶粉、蔗糖、甘油、吐温、谷氨酸钠等。而实际上，保护剂的作用会随菌株种类的不同，保护剂的种类及配比表现的一定的差异。因此，需找到最佳的干燥方法及保护剂配方以减少干燥过程对微生物细胞的影响。保护剂对微生物干燥效果的影响很大，保护剂的选择是最为关键的一步。

冷冻干燥是目前大多数微生物干燥的主要方法。但是大量研究显示,微生物胞内多数酶类在冻干过程中会受到较大影响,但目前尚未有较好的方法来防止这些酶在冻干时发生活性的改变。另一方面,冷冻干燥同时有许多不足: 冻干过程操作复杂、仪器成本高、干燥时间长、工艺条件较为苟刻, 影响了微生态制剂工业化、商品化进程。相比而言,室温干燥法消耗能源少、工艺简单、成本低廉，更适于大型生产。

发明内容

本发明改变了工业上采用2L的三角瓶静置培养，固体发酵制备麸曲孢子的方法。通过对孢子增殖方式进行优化，得到高数量、高质量的黑曲霉干孢子粉。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

本发明研究过程中所用黑曲霉为CMCC2450 是公知的菌株。

一种采用载体吸附进行黑曲霉孢子增殖的制备方法，其特征在于将一定比例的玉米与麸皮混合，然后高温淀粉酶液化，过滤，加入粉碎的玉米轴颗粒混合，灭菌，接种黑曲霉孢子，固态发酵罐培养，洗脱孢子悬液后加入复合保护剂，孢子悬液与复合保护剂体积比为2∶3，平衡时间为40 min，最后真空干燥，收集黑曲霉干孢子粉；且按如下的步骤进行；

固态发酵罐37℃培养120h→洗脱孢子→加入保护剂→平衡40分钟→35℃真空干燥16h→收集干孢子。

（1）黑曲霉孢子增殖培养液的制备：

将玉米和麸皮按重量比为7:3的比例混合，按照固形物总重量与水的体积比为1:5，将玉米麸皮与水混合，按玉米重量每克12个单位将高温淀粉酶加入到上述混合物中液化，100℃煮沸30分钟，过滤，滤液定溶到原加水体积，即获得黑曲霉孢子的培养液；

（2）固态发酵罐载体增殖黑曲霉孢子培养的制备：