[发明专利]用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。

背景技术

乙酰胆碱酯酶是降解乙酰胆碱的水解酶。乙酰胆碱酯酶存在于神经传导组织和红细胞膜，在神经细胞突触和神经肌肉接点-运动终板的发育过程中具有重要作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂通过抑制乙酰胆碱水解酶活性阻断神经之间，神经和肌肉间的信号传递，影响神经和运动功能并导致动物瘫痪和死亡。乙酰胆碱酯酶抑制剂被广泛应用于治疗阿尔茨海默病、神经毒剂和杀虫剂(沙林、VX毒气、有机磷和氨基甲酸类农药等)。由于有机磷农药具有毒性强、毒性效应广、在环境中可快速降解等特点，被广泛应用于农业生产和作为室内外杀虫剂。有机磷和氨基甲酸类农药的广泛使用对食物、水和土壤的污染引起了公众对健康影响的关注，对生态环境安全的担忧。评价乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质对人类健康和环境的影响效应，研究、发明特异性好，高效的检测乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质的方法和技术成为关键。

检测环境中乙酰胆碱酯酶抑制剂的水平已经被广泛用做土壤、水环境中有机磷农药的动物暴露水平和导致动物生理效应的评价指标。分析化学技术虽然可以分析、辨别目前食物、生物和环境样品中多数有机磷和氨基甲酸类化学物质，但是这些技术需要特殊的分析仪器和专业人员，限制了其应用范围。同时绝大多数有机磷类农药在环境中快速降解，经过几小时或者数天后有机磷农药的浓度会低于仪器的检测限，直接影响分析结果。检测乙酰胆碱酯酶活性的电化学装置不但需要制备灵敏性高的乙酰胆碱酯酶，而且乙酰胆碱酯酶抑制剂会导致感应器中乙酰胆碱酯酶活性的不可逆性抑制，影响电化学感应器的重复使用。基于细胞活性的检测方法具有快速、敏感性高的特点，但是不能反映乙酰胆碱酯酶抑制剂在生物体内代谢的相关信息，同时细胞对不同类型的化学物质的生物学效应具有相似性，直接影响乙酰胆碱酯酶抑制剂检测的特异性。

斑马鱼具有个体小、养殖费用低、生长周期短、产卵量大、胚胎透明和体外发育等优点，被广泛用于遗传、发育、环境毒理和人类疾病等方面的研究。用斑马鱼评价环境化学污染物的毒性效应的标准方法已经建立并得到广泛应用(OECD 203,OECD 236,ISO 7346)，但是这些标准方法检测污染物毒性效应的敏感性较低，特异性不高。通过基因重组技术，构建表达荧光蛋白的转基因斑马鱼已经被广泛应用于研究发育过程中基因调控，药物的作用位点和安全性评价等领域。表达荧光蛋白的转基因鱼不但能用于研究化学物质诱导的靶基因的表达活性，还可以半定量分析化学物质在组织和器官的累积量，为化学物质毒性的生物学效应评价提供了一种敏感性高，重复性和特异性好的方法。一些对环境中一种或者一类化学物质敏感性高，特异性强的表达荧光蛋白的转基因斑马鱼已经被用于评价环境中重金属和有机化学污染物的毒性效应和机理研究。目前所有构建的转基因鱼不能或不适合用于检测环境样品中具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。

首先，本发明提供了一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法。

本发明所提供的利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，具体可包括如下步骤：

(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24-72小时(如44-48小时)暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；

所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；

所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；

所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；

(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；