[发明专利]用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法

权利要求书

1.一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，包括如下步骤：

(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24-72小时暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；

所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；

所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；

所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；

(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；

所述本底值为没有加入所述待测物质的所述转基因斑马鱼培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。

2.一种检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染的方法，包括如下步骤：

(B1)用同一常数稀释因子稀释待测水体为不少于5个浓度，在转基因斑马鱼培养体系中分别加入所述不少于5个浓度的所述待测水体，24-72小时后检测所述转基因斑马鱼肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；

所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；

所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；

所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；

(B2)如果步骤(B1)的检测中存在任何一个浓度导致所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测水体被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染或疑似被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；反之，则所述待测水体未被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；

所述本底值为没有加入待测水体的所述转基因斑马鱼的培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述修饰后的BAC DNA是通过目的DNA片段与编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA发生同源重组后得到的；所述目的DNA片段包括位于两端的上下游同源臂序列和位于中间的荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；其中，上游同源臂序列为序列表中序列1，下游同源臂序列为序列表中序列2；

在所述转基因斑马鱼B中，所述hspb11基因6kb上游调控序列如序列表中序列5所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述编号为DKEY-30K6的斑马鱼BAC DNA的GenBank登录号为AL844141.7；所述荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为卡那霉素抗性基因；

在所述转基因斑马鱼B中，所述荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白的编码基因；所述抗性筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述转基因斑马鱼A中，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第470-1246位；所述卡那霉素抗性基因为序列表中序列3的第1999-2793位；

在所述转基因斑马鱼B中，所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列6的第100-816位；所述氨苄青霉素抗性基因为序列表中序列6的第2293-3153位。