[发明专利]一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法

说明书

本发明公开了一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法，筛选方法包括（1）将生物组织对照样本和参考样本（病理样本）匀浆、裂解；（2）将裂解液进行酶解、除盐等操作；（3）用LC‑MS/MS液质联用的方式进行蛋白质鉴定；（4）通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析样品蛋白的丰度变化，以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC‑MS上的积分，以MS2的鉴定结果为定量基础，大规模对数据进行修正；（5）通过修正的数据分析结果筛选出显著上调或下调的蛋白质生物标志物。本发明操作不需用昂贵的标记试剂，成本低廉，一次筛选数量多，筛选结果准确。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用蛋白质组学定量技术大规模筛选蛋白质生物标志物的方法。

背景技术

生物标志物（Biomarker）是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。 检查一种疾病特异性 的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平（分子、细胞、个体等）上因受环境污染物 影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢 过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理 活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，可以是生态系统 的异常变化。

从功能上一般分为：接触（暴露）生物标志物（biomarker of exposure），效应生物标志物（biomarker of effect），敏感性生物标志物（biomarker of susceptibility）

生物标志物可以阐明各种污染物的作用机理，确定各种污染物与生物体之间已发生的相互作用，并与生态学效应相联系，从而制定研究解决环境问题的方案 (如种群水平的下降等)。生物标志物研究的主要目的是为了改善总体人群的健康状况，并降低罹患以下疾病的风险：如身体机能及消化系统疾病、免疫系统及神经系统功能障碍、动脉粥样硬化、肥胖症、糖尿病、癌症以及骨质疏松症。此外，标志物还可以用于流行病学或毒理学研究，以判断生物是否暴露于某些环境因素中（如有毒化学品、微生物等）。

研究不同生理病理条件下组织内蛋白质的表达水平的变化是比较蛋白质组学的核心内容。要揭示上述动态过程往往需要进行多个样本的同步比较分析。近年来，在体内和体外稳定同位素标记基础上，用多维相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。蛋白质定量，作为后基因组时代的一个非常重要的领域，在生物系统及疾病和医疗领域起到了非常重要的作用。研究和分析差异蛋白则在阐明医药分子、药物靶标筛选及发现和验证蛋白生物标记物等领域起到了重要的一环。除了传统的2D-PAGE鉴定差异蛋白以外，近些年来，质谱技术已经日新月异，成为了蛋白相对和绝对定量的关键手段。其中研究蛋白相对和绝对定量的常用质谱分析技术是同位素标记，包括如SILAC、iTRAQ。

1.iTRAQ的定量蛋白质组学分析

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国AB Seiex公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用多达8种稳定同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较多达8种不同样品中蛋白质的相对含量。

2. SILAC的定量蛋白质组学分析