[发明专利]一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法

权利要求书

1.一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将生物组织对照样本和参考样本匀浆、裂解；

（2）取上述蛋白质提取液用点样仪点样并分别固定在96孔板中反应1小时；将板用含有脱脂奶的溶液封闭，将孔板中的物质取出，用玻璃棒碎胶，用缓冲液溶解和浸泡过夜，离心后取上清液浓缩，将浓缩液用超声波辅助酶解15s，将酶解液用0.45μm滤膜过滤；其中采用缓冲液为0.25-0.3%溴酚蓝溶液：0.25-0.3%二甲苯青FF：40%蔗糖水溶液=15-25:15:60-70；

（3）将步骤（2）的滤液用LC-MS/MS液质联用的方式进行蛋白质鉴定；

液相色谱条件为：色谱柱为MONO-Q柱；进样量10μL；

流动相A为10mmol/L的NaOH，流动相B为：10mmol/L的NaOH+1.8mol/L的NaCl；梯度为0-5min，0%B,5-23min，0-80%B,23-35min，100%B，流速：0.2mL/min；检测波长UV230nm检测；

质谱测定参数设置为：质荷比范围400-5000，步长0.25，扫描时间6s，低OR电压35V，高OR电压100V；其它参数设置均按照PPG校正仪器后的参数设置；

（4）采用label free定量方法以MS1和MS2质谱数据为基础，进行数据分析；通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析样品蛋白质的丰度变化，以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC-MS上的积分，以MS2的鉴定结果为定量基础，大规模对数据进行修正；

（5）通过修正的数据分析结果筛选出显著上调或下调的蛋白质生物标志物。

2.根据权利要求1所述的一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法，其特征在于，步骤(1)将所述对照样本和参考样本混合，不需用同位素或其他标签进行任何体内或体外标记。