[发明专利]一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述重组水蛭素的N末端含有可被MMP9识别并裂解的寡肽序列，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述寡肽序列为可被MMP9识别并裂解的短肽，其结构特征为XnGI，Xn代表任意数量的任意氨基酸。

3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性重组水蛭素，其特征在于，所述重组水蛭素是在水蛭素异构体HV2或HV3的N末端修饰有寡肽PLG，与水蛭素异构体HV2或HV3的N末端的异亮氨酸共同组成MMP9识别并酶切的底物肽序列PLGI，重组水蛭素PLG-HV2氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，基因序列为：SEQ ID NO.2，重组水蛭素PLG-HV3氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，基因序列为：SEQ ID NO.4；

或者，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35，再在其N末端修饰PLG寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，基因序列为：SEQ ID NO.6，重组水蛭素PLG-HV3-RGDS氨基酸序列为：SEQ ID NO.7，基因序列为：SEQ ID NO.8；

或者，所述重组水蛭素，是将野生型水蛭素HV2或HV3肽链的Ser32-Asn33-Gly34-Glu35替换为Arg32-Gly33-Asp34-Met35，再在其N末端修饰PLG寡肽，所述重组水蛭素PLG-HV2-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.9，基因序列为：SEQ ID NO.10，重组水蛭素PLG-HV3-RGDM氨基酸序列为：SEQ ID NO.11，基因序列为：SEQ ID NO.12；

或者，所述重组水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽RGD4C与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过Linker和寡肽PLG连接而成的融合蛋白RPH2，或RPH3，RPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.13，基因序列为：SEQ ID NO.14，RPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.15，基因序列为：SEQ ID NO.16；

或者，所述重组水蛭素，是人白蛋白与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白HPH2，或HPH3，HPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.17，基因序列为：SEQ ID NO.18，HPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.19，基因序列为：SEQ ID NO.20；

或者，所述重组水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白Fc段与N末端氨基酸是I的水蛭素异构体HV2或HV3通过寡肽PLG连接而成的融合蛋白FPH2，或FPH3，人嵌合免疫球蛋白Fc段包含人IgG4铰链区、Fc段序列和IgM尾片序列，FPH2氨基酸序列为：SEQ ID NO.21，基因序列为：SEQ ID NO.22，FPH3氨基酸序列为：SEQ ID NO.23，基因序列为：SEQ ID NO.24。

4.肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：化学合成权利要求1～3任一项的肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其N末端连接信号肽序列，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因插入载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

5.权利要求1～3任一项所述的肿瘤特异性重组水蛭素在制备抗凝、抗血栓、防治肿瘤的药物中的应用，尤其是防治肿瘤伴发高凝状态和血栓性病变的药物、保健品和功能性食品中的应用。

6.表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，其特征在于，体外培养人源免疫细胞，将人源分泌型信号肽编码基因与权利要求1～3任一项的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因插入载体中制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。