[发明专利]一种轴向单分子高精度定位方法和装置

说明书

本发明属于超分辨定位荧光成像技术领域，涉及一种轴向单分子高精度定位的荧光定位方法装置及其使用方法。本发明结合单分子定位的高精度特点，利用单分子轴向高斯光强分布响应曲线在焦点处斜率最大的特性，实现了单分子轴向的精确定位，继而实现了超分辨荧光成像。本发明包括激光器A、激光器B、物镜、三维样品位移台、轴向定位系统等；激光器A和激光器B用于对荧光分子的激发和激活。其中轴向定位系统由分光棱镜、透镜和EMCCD组成，荧光进入轴向定位系统后，经透镜后成像在EMCCD处；EMCCD位置相对焦点是对称的。

技术领域

本发明属于超分辨定位荧光成像技术领域，涉及一种轴向单分子高精度定位的荧光定位方法装置及其使用方法。

背景技术

现代生物医学研究中为了更好地理解生命的作用过程和疾病的产生机理，往往需要观察细胞内的细胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布情况。与此同时，蛋白质科学研究也要求阐明蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，是如何组成细胞基本结构体系的；重要的活性因子是如何调节细胞内主要生命活动的，如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化与细胞信号传递等。反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，虽然应用传统的电子显微镜可以在纳米量级分辨率观察到细胞内囊泡、线粒体等细胞器的定位，但由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程。因此，生物学家迫切希望有一种显微实验方法，在不影响生物活性的情况下，它既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化过程。

近年来，在荧光显微镜领域，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的不断改进，超分辨显微成像技术由于突破了衍射极限，达到了可以与电子显微镜相媲美的精度及数十纳米的分辨率。目前常用的超分辨荧光技术是以纳米级空间分辨率直观显示单分子空间分布情况并利用荧光分子本身的开关效应来进行定位的显微成像技术，该技术在不同时刻获取稀疏分布的被荧光分子标记的单分子定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠加，最终实现高横向纳米分辨率。单分子定位是超分辨荧光成像过程中不可缺少的环节，而实现轴向高分辨率是一个待解决的问题。

本发明人提出了一种新型的轴向单分子高精度定位方法，利用本技术方法不仅提高了轴向分辨率，而且有效地对偏移量和偏移方向进行了指定。

本发明以光强作为数据信息，且不易受环境干扰，将本技术应用于单分子定位，相比以往的测量方法具有精度高、抗干扰能力强等诸多优点。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了克服现有单分子技术中轴向分辨率低的不足，本发明提出了一种基于单分子轴向定位法的超分辨荧光成像方法和装置。本发明结合单分子定位的高精度特点，利用单分子轴向高斯光强分布响应曲线在焦点处斜率最大的特性，实现了单分子轴向的精确定位，继而实现了超分辨荧光成像。

本发明的目的是要解决单分子定位系统轴向分辨率低的问题，提出了一种利用焦面对称接收信息精确定位荧光分子轴向位置的方法和装置。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

(二)技术方案

本发明提出了一种轴向单分子高精度定位方法，包括以下步骤：

(a)首先将实验样品的位置调整到显微镜物镜焦平面上；

(b)然后激光A低能量照射实验样品表面，激活出焦面处的几个荧光分子，激光B照射样品激发出荧光分子，位移台在焦面处上下各移动200nm，EMCCD记录下各处图像，再使用激光B长时间照射样品对荧光分子进行漂白，之后分别用激光A和激光B来激活和漂白其他的荧光分子，并进入下一个循环，当循环持续上百次后，得到样品内荧光分子在轴向的图像；