[发明专利]用于检测HER2基因的FISH探针、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种用于检测HER2基因的FISH探针，同时本发明还涉及该FISH探针的制备方法及应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，仅次于宫颈癌。流行病学调查发现，5％～10％的乳腺癌是家族性的，有明显的家族遗传倾向。在40～60岁间、绝经期前后的妇女发病率较高。在我国，妇女乳腺癌发病率正逐年上升，并且显示出年轻化趋势。与30年前相比，我国乳腺癌死亡率上升了34.1％，其中城市上升了38.8％，它正以每年3％～4％的速度递增，死亡率已经排在女性癌症死亡率之首。乳腺癌病因尚未完全阐明，但许多研究资料表明，乳腺癌的发生除去出生地的因素外，还与内源性或外源性雌激素的长期刺激：雌激素的活性和表皮生长因子受体(HER2)的过表达对乳癌的发生有重要作用。

人类HER-2/neu基因(Her-2基因)定位于染色体17q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成员之一。HER-2/neu蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，由于目前尚未发现能与HER-2/neu蛋白直接结合的配体.其主要通过与家族中其他成员包括EGFR(HERl/erbBI)，HER3/erbB3，HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结合。HER-2/neu蛋白常为异二聚体首选伴侣，且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活性。HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达情况及影响因素HER-2/neu蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性。肾细胞癌、子宫内膜癌等，并提示预后不良。荧光原位杂交的方法检测乳腺癌细胞中HER-2/neu基因(17q12)的扩增，作为判断预后以及乳腺癌药物治疗，尤其是抗HER-2单克隆抗体(赫赛汀)靶向治疗的一项辅助检测手段。

目前检测HER2基因的方法包括:免疫组织化学(IHC)法检测HER2蛋白过表达、荧光原位杂交(FISH)法检测HER2基因拷贝数、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HER2ECD或肿瘤组织P185。但病理常规工作中最实用的方法是IHC和FISH。IHC较FISH节约成本、简单易行,但容易受到组织处理方法、固定时间等影响,其结果判断和解释存在较大的变异,而FISH具有高度的重复性和可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法。

一种用于检测HER2基因的FISH探针的制备方法包括以下步骤：

a、提取探针合成模板：利用基因组DNA提取试剂盒提取人类基因组DNA，作为HER2基因以及17号染色体着丝粒区域检测探针合成的模板；

b、第一步PCR反应：采用第一组PCR反应引物，以人体基因组DNA为模板，进行PCR体系的扩增，得到DNA产物；

c、第二步PCR反应：采用第二组PCR反应引物，以与其对应的第一步PCR反应获得的DNA产物为模板进行PCR体系的扩增，得到第二步PCR反应产物；

d、纯化：将第二步PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用PCR产物凝胶回收试剂盒进行切胶、回收、纯化，得到检测HER2基因的FISH探针；

所述的第一组PCR反应引物包括HER2基因第一组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第一组PCR反应引物；

所述的第二组PCR反应引物包括HER2基因第二组PCR反应引物和17号染色体着丝粒区域第二组PCR反应引物。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

利用两对引物、分别进行两步PCR获得探针，如果第一次PCR体系的扩增产生了错误片断，则第二次PCR体系的扩增能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此，增加了扩增特异性。同时通过两步PCR放大，提高了探针制备效率且降低了生产成本。

进一步的，步骤b第一步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、2×Es Taq MasterMix。

进一步的，步骤c第二步PCR反应中包含以下组分：反应引物、模板、dNTP、荧光标记的dUTP、Taq DNA聚合酶、含Mg²⁺的10×Taq酶反应缓冲液。