[发明专利]一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法

说明书

一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，由耐热α‑L‑鼠李糖苷酶和耐热β‑葡萄糖苷酶组成的双酶体系协同转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷生成淫羊藿苷元。本发明可将淫羊藿总黄酮中多组分黄酮类化合物（淫羊藿苷、朝霍定A、朝霍定B及朝霍定C等）几乎完全转化为目的产物；最适作用温度高，使得底物及中间产物都具有良好溶解性，不需要助溶剂；酶解时间短，得率高。本发明制备得到的淫羊藿苷元针对肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌的增殖抑制作用显著高于转化前的淫羊藿总黄酮各单体。

技术领域

本发明属于酶工程及生物医药领域，具体涉及重组酶体系在催化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元中的方法。

背景技术

淫羊藿苷元(Icaritin)为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体成分，它在淫羊藿体内含量极低,为淫羊藿苷的水解产物,具有雌激素样作用、调节免疫、促进心肌细胞再生和分化、促骨质保护、壮阳、抗肝损伤及延缓肝纤维化、抗肿瘤等多种药理活性。随着国内外对淫羊藿苷元的新药效的发现,未来淫羊藿苷元的国际市场需求很大。因此如何开发高效环保地制备淫羊藿苷元的方法是目前研究的重点。

由于淫羊藿苷是淫羊藿的含量最较高的黄酮苷类化合物之一，它与淫羊藿苷元具有相同的母核，因此，目前淫羊藿苷元的制备主要针对淫羊藿苷，采用酶法或酸法将其母核3号及7号碳位上的糖基去除从而获得淫羊藿苷元。如CN 103305564通过酶解、酸解相结合，将淫羊藿苷转化为淫羊藿素，但由于酸解反应过程可控性差，副产物多，产品收率低，关键是强酸性条件容易改变黄酮母核的结构特别是4’号位的甲氧基，使其工艺具有局限性；CN101302548通过一种商品化的β-葡萄糖苷酶将淫羊藿苷转化为淫羊藿苷元，虽然该酶能获得淫羊藿苷元，但是其水解时间长(24小时)，最高酶解收率也仅为55％左右，根据酶解效果及酶专一性特性，可知使用的β-葡萄糖苷酶来源于传统微生物发酵，其酶不是纯的β-葡萄糖苷酶；CN 104561178采用柚苷酶将淫羊藿苷转化生成淫羊藿苷元。柚苷酶是由微生物发酵制备获得的具有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的复合酶，专一特性主要为特异性水解柚皮苷。该方法中α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶比例不可控、作用的先后顺序不可控，且反应时间长(30小时)，效率低(该专利仅说明能够生成淫羊藿苷元)。

综合现有研究结果可以发现：(1)目前的研究工艺只能以淫羊藿苷为底物制备淫羊藿苷元，还无法将淫羊藿总黄酮的主要组份(淫羊藿苷、朝霍定A、朝霍定B及朝霍定C)同时转化为淫羊藿苷元；(2)目前制备淫羊藿苷元的得率及效率还有待提高。(3)已有技术中，在制备过程中，首先要获得淫羊藿提取物，然后分离得到淫羊藿苷，然后通过酶法或微生物法转化，不仅大大增加了成本，而且没有充分高效利用朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C。另一方面，使得大量获取淫羊藿苷资源问题非常突出，无法保障规模化制备淫羊藿苷元。而本发明提供了一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，仅仅通过二种糖苷酶，就能高效地将淫羊藿总黄酮几乎完全转化制备得到淫羊藿苷元。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，从微生物来源的糖苷水解酶基因库中成功筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α-L-鼠李糖苷酶及一种高效降解其母核结构中葡萄糖残基和木糖残基的耐高温双功能β-葡萄糖苷酶，仅仅通过二种糖苷酶，就能高效地将淫羊藿总黄酮中多种淫羊藿苷几乎完全转化制备得到淫羊藿苷元。有效降低了制备成本和提高了资源高效利用率。

技术方案：一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，由耐热α-L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成的双酶体系均能转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷生成淫羊藿苷元，所述多组分黄酮糖苷为淫羊藿苷、朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C。

上述耐热α-L-鼠李糖苷酶来源于Thermotoga petrophila DSM 13995的α-L-鼠李糖苷酶基因的大肠杆菌重组菌。

上述耐热β-葡萄糖苷酶来源于Dictyoglomus thermophilum DSM 3960GH3β-葡萄糖苷酶基因的大肠杆菌重组菌。