[发明专利]对虾肝肠胞虫海藻糖-6-磷酸合成酶基因的检测与应用

说明书

对虾肝肠胞虫海藻糖‑6‑磷酸合成酶基因的检测与应用，涉及对虾肝肠胞虫。通过提取感染对虾肝肠胞虫的对虾的总RNA，进行逆转录，再经过特异性引物扩增，鉴定1个海藻糖‑6‑磷酸合成酶基因。根据该基因序列信息，设计最佳的引物，用于实时定量PCR方法，为检测该基因在对虾中的转录表达水平提供了基础。通过实时定量PCR方法检测对虾肝肠胞虫海藻糖‑6‑磷酸合成酶基因在对虾中的转录水平，可以应用于对虾肝肠胞虫病的检测。该方法具有灵敏度高，特异性好的特点，将为对虾病害防治提供信息和方法。

技术领域

本发明涉及对虾肝肠胞虫，尤其是涉及对虾肝肠胞虫海藻糖-6-磷酸合成酶基因的检测与应用。

背景技术

对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)又称肠胞虫，是近年来发现于对虾中的微孢子虫，主要感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)等重要养殖虾类^[1]。它于2009年在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾(Penaeusmonodon)中首次被分离和命名^[2]。

近年，在我国浙江、广东、福建等多省的对虾苗种和养殖虾中检测到较高的EHP阳性虾，且检出率逐年增加^[3]。对虾感染对虾肝肠胞虫后一般不出现立即死亡，虾可正常摄食，体色、肠、胃均明显异常，个别感染虾可出现白便，使得该病很难早期发现。通常养殖30～45天以上才可发现生长缓慢，严重影响了对虾的养殖生产，且造成该病这几年在对虾养殖地区迅速流行和传播。对虾肝肠胞虫寄生于细胞内，虫体长度为0.75～1μm^[2]，用光学显微镜常规镜检很难发现。目前，已经报道的用于EHP检测方法包括PCR方法^[4]、地高辛标记核酸探针原位杂交法^[4]以及LAMP检测方法^[5]。但这些检测方法也存在缺点，包括只能对该种病原微生物进行定性描述，无法进行定量研究，灵敏度和特异性不足等^[6]。因此，建立快速、可靠的EHP检测方法，对及时发现EHP携带和感染对虾，减少病原传播扩散有积极的意义。

海藻糖是一种非还原性二糖，由两个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成的。它在自然界的动植物与微生物中广泛存在，包括原核生物、藻类、细菌、真菌、低等植物以及无脊椎动物。海藻糖具有保护生物膜、保持蛋白质等大分子不被变性失活等性质，由此来维持生命体的生命过程和生物特征，帮助生物体抵御许多逆性环境，如干燥脱水、高温、冷冻、高渗等状态等。在海藻糖合成途径中，海藻糖-6-磷酸合成酶是其中的关键酶，对实现海藻糖在生物体内的富集起着重要作用。目前，研究人员已对许多物种(如烟草、酵母、蟹等)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因进行了克隆和研究。

参考文献：

[1]Siripong Thitamadee,Anuphap Prachumwat,Jiraporn Srisala,etal.Review of current disease threats for cultivated penaeid shrimp in Asia[J].Aquaculture，2016，452:69-87.

[2]Tourtip S,Wongtripop S,Stentiford GD,et al.Enterocytozoonhepatopenaei sp.nov.(Microsporida:Enterocytozoonidae),a parasite of the blacktigershrimp Penaeus monodon(Decapoda:Penaeidae):Fine structure andphylogenetic relationships[J].J Invertebr Pathol,2009,102(1):21-29.