[发明专利]一种高效的基因工程载体

说明书

本发明提供具有5’‑A1‑B1‑C‑B2‑A2‑D‑3’或5’‑D‑A1‑B1‑C‑B2‑A2‑3’所示结构的核苷酸构建物，其中A1、A2是同向重复序列，B1、B2是反向重复序列，C是标记基因，D是外源基因表达盒。本发明还提供包含所述核苷酸构建物的表达载体以及在其基因组中整合有所述核苷酸构建物的宿主细胞。本发明的核苷酸构建物及载体通过两次重组而将大量外源基因整合在基因组中，能够有效循环使用选择标记，专一性地破坏基因组中的靶基因的表达，或者保持靶基因的正常表达，从而可广泛应用于完成基因组大规模改造项目。

技术领域

本发明涉及生物技术领域；具体地说，本发明涉及通过两次重组而将大量外源基因整合在基因组中，同时避免破坏宿主细胞基因的新型基因工程载体。

背景技术

酵母在现代生物工程技术中有许多应用。随着代谢工程、系统生物学与合成生物学的发展，酵母成为重要的生物系统，应用于生产各种小分子化合物，包括酒精类、糖衍生物类、有机酸类、脂肪类、萜类、芳香类、和酮类化合物(Leqian Liu,Heidi Redden and HalS Alper,Frontiers of yeast metabolic engineering:diversifying beyond ethanoland Saccharomyces,Current Opinion in Biotechnology 2013,24:1023–1030)。常规酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),是一种被全面研究的模式真核生物，在基因工程技术发展早期就应用于生物医药产品的表达生产。1987年用酿酒酵母生产的重组人胰岛素获得成功后，目前已经有几十种酿酒酵母生产的药品在欧美获得批准进入市场。随后非常规酵母，例如巴斯德毕赤酵母(毕赤酵母)(Pichia pastoris)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等也发展成为具有前景的重组蛋白表达系统。首个用毕赤酵母生产的激肽释放酶血管舒缓素抑止剂(Kallikreininhibitor)已于2009年在美国进入市场，而且还有其它产品正在临床试验中(Walsh，Biopharmaceutical benchmarks，Nat Biotechnol 2010；28:917–24)。

在合成生物领域的最新发展，包括酵母人源糖基化工程和代谢工程等，需要对生物细胞进行基因工程改造，将许多外源基因整合在基因组中进行表达，构建有利于表达生产不同目标产品的生物细胞。为了完成复杂的基因工程项目，需要有不同的载体、选择标记、和基因组位点可供选择使用。

但是当载体通过单交换重组整合在基因组靶基因位点，会导致靶基因的重复，形成同向重复序列。同向重复序列之间可以再次发生同源重组，切除整合的外源载体，恢复靶基因原来的状态。而且，由于通过不同位置的同向重复序列之间的同源重组可以将靶基因恢复成野生型或者缺陷型的状态，无法通过选择筛选条件来防止这个重组切除载体过程的发生。因此，载体通过单交换重组整合在基因组中，具有遗传不稳定性。