[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法

说明书

本发明公开一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZP26（保藏号为CGMCC NO.8665）基因组上整合了异源木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶编码基因以阻断副产物乙酸生成；并通过适应性驯化策略显著提高了工程菌株共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明首次成功实现了乳酸片球菌中木糖代谢路径的构建，得到一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯D‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY15，其保藏号为CGMCC NO.13612。

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种利用热敏型敲除系统，基于同源重组原理的共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法。

背景技术

D-乳酸是一种重要的工业化学品，它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织业。近年来，以D-乳酸为前体生产生物可降解性塑料聚乳酸，使得光学纯D-乳酸的需求大大提升。但是，目前世界D-乳酸产量的90%都是由淀粉类原料进行发酵得到的，这就存在“与人争粮”问题。寻找更加便宜的原料进行D-乳酸生产将有助于减少粮食危机。木质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源，利用含量丰富的木质纤维素原料生产D-乳酸是一种非常有前途的选择，并且已经有大量研究开始利用木材、农业废弃物等木质纤维素原料进行D-乳酸生产。

木质纤维素的主要组成部分是纤维素（30-60%干重）、半纤维素（20-40%）和木质素（15-25%）。其中纤维素来源的葡萄糖可以被微生物利用进行生物基化学品的生产。半纤维来源的木糖约占木质纤维素来源总糖含量的约30%，然而绝大部分生物炼制菌株都不能利用木糖，这限制了木质纤维素原料进行高浓度生物基化学品生产。本实验室先前工作中，筛选得到一株乳酸片球菌P. acidilatici DQ2，该菌可以很好的适应木质纤维素体系，并可以利用玉米秸秆原料产生103g/L的乳酸。之后通过基因工程改造敲除了乳酸片球菌P.acidilatici DQ2基因组上L-乳酸脱氢酶编码基因ldh，得到的工程菌株P. acidilaticiZP26可以利用25%（w/w）固含量的玉米秸秆原料产生77.76 g/L的D-乳酸，但其不能利用木糖。如果将木糖代谢路径构建至P. acidilatici ZP26，利用玉米秸秆生产D-乳酸的产量必将大大提高。

乳酸菌利用木糖进行乳酸生产一般是通过以下两种路径进行的。（1）磷酸转酮酶路径（PK路径）：木糖在木糖异构酶作用下被异构化为木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶作用下磷酸化成5-磷酸木酮糖，然后5-磷酸木酮糖在磷酸转酮酶作用下裂解为三磷酸甘油醛（GAP）和乙酰磷酸，最后前者进入糖酵解路径生成乳酸，而后者进一步转化为副产物乙酸；（2）戊糖磷酸路径（PP路径）：木糖同样在木糖异构酶和木酮糖激酶作用下被转化为5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖在转酮醇酶和转醛醇酶的作用下最终转化为GAP进入糖酵解路径生成乳酸。其中PP路径代谢木糖时只产生乳酸，而无副产物乙酸等生成，因此PP路径是进行木糖代谢生成乳酸的最佳路径。