[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法

权利要求书

1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的构建方法，其特征在于，步骤包括：

（1）启动子与xylAB基因簇的优化：木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB是木糖代谢的两个最主要基因，xylA和xylB的表达水平直接决定了木糖的代谢速率，因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB从而提高xylAB基因的表达水平；优化得到的表达框为PldhD_xylAB_2911，其中，启动子PldhD的编码序列为SEQ ID NO:6，基因簇xylAB_2911的序列为SEQ ID NO:9；

（2）xylAB基因组整合表达：将步骤（1）中得到的PldhD_xylAB_2911表达框，通过同源重组整合至P. acidilactici ZP26基因组上，所述P. acidilactici ZP26的保藏号为CGMCCNO.8665；

（3）磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除：在步骤（2）得到的菌株基础上，通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt，以减少副产物乙酸生成；

（4）转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合：在步骤（3）得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶和转醛醇酶编码基因tkt-tal整合至其基因组上，所述基因tkt-tal的序列为SEQ ID NO:16；

（5）适应性驯化：将步骤（4）得到的菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中使用的表达质粒为pMG36e。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）、（3）和（4）中使用的敲除和整合质粒均为热敏型敲除质粒pSET4E。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中将表达框PldhD_xylAB_2911整合至P. acidilactici ZP26基因组上已经缺失的ldh基因位点处，得到的重组菌株为P. acidilactici ZP26::xylAB，其能利用木糖进行D-乳酸生产，但同时有大量副产物乙酸生成。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中得到的工程菌株为P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt，其利用木糖进行代谢的PK路径被阻断，利用木糖能力显著下降。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中使用的tkt_tal基因来源于P. acidilactici DSM 20284，所用的启动子为PldhD，通过融合PCR将PldhD和tkt_tal进行融合，得到表达框PldhD_tkt_tal。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中将表达框PldhD_tkt_tal整合至步骤（3）得到的工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt已缺失的pkt基因位点处，获得的工程菌为P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt::tkt_tal，其利用木糖进行同型乳酸代谢的PP路径被成功构建，但该工程菌木糖代谢速率很慢。