[发明专利]高F值寡肽粗液分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽分离纯化技术领域，具体是一种高F值寡肽粗液分离纯化方法。

背景技术

带鱼（Largehead Hairtail），别称刀鱼、牙带鱼，属于脊索动物门、鲈形目，体型呈带状。主要分布于西太平洋和印度洋，在中国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。

2014年度，舟山市带鱼捕获量达到108104吨，占主要渔获品种的比例达到11.52%。舟山带鱼多以新鲜或加工成各种鱼制品出售，然而带鱼的开发利用依然处于粗加工阶段，高附加值的利用程度较低。

带鱼的平均蛋白含量达到18.4%以上，这使得它成为丰富的蛋白质原材料来源。蛋白质经过酶解等特殊处理，可以制备具备一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我国对带鱼蛋白的研究虽然取得了一些进展，但是还未能开发出高活性的蛋白，还未能更佳充分地开发利用带鱼资源。因此，对带鱼蛋白的深入研究，开发出具备高附加值的带鱼蛋白产品成为迫在眉睫的问题。

高F值寡肽是一类由2-9个氨基酸以独特的方式组合成的小肽混合物，其主要特征是氨基酸混合物中支链氨基酸与芳香族氨基酸比值远高于人体模式。支链氨基酸中的缬氨酸（Val）异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）具有维护神经系统正常、增加食欲、治疗贫血、促进伤口痊愈等特殊的生理功能。在临床上，高F值寡肽常用来用来治疗肝性脑病，苯丙酮尿症，改善病人术后的营养状况等。近年来，国内高F 值寡肽开发方面成为功能食品的研究热点。如以大豆、玉米、花生等植物为原料，以金枪鱼、鱿鱼、牡蛎等水产品为原料制备的高F值寡肽。目前对于带鱼高F值寡肽的开发研究仅处在实验室水平的探索，市面上的制成品寥寥无几。

目前，较为流行和科学的制备高F值寡肽方法是采用双酶分布酶解法。其主要工艺是首先通过酶解使蛋白肽链的芳香族氨基酸残基位点暴露出来，然后用某些特定蛋白酶酶解切掉芳香族氨基酸，使之以游离态存在于溶液中，再用其他方法最大化去除芳香族氨基酸。制备高F寡肽的关键是尽可能的保留支链氨基酸（Val、Ile、Leu简称BCAA），去除芳香族氨基酸（Tyr、Phe，简称AAA），达到BCAA/AAA的摩尔浓度比大于20。

现有技术如授权公告号为CN104004087B的中国发明专利，公开了一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括： （1）水蛭干体初步清洗除杂，高速粉碎；（2）原料碱预浸泡；（3）碱性蛋白酶Alcalase AF 2.4L结合木瓜蛋白酶双酶水解；（4）采用活性炭粉静态吸附脱除芳香族氨基酸；（5）以凝胶过滤层析柱进一步分离纯化，收集分离产物，冷冻干燥 ，获得分子量低于2000Da，F值（Fischer ratio，即支链氨基酸与芳香族氨基酸摩尔含量的比值）高于20的水蛭寡肽粉。该方法制备过程简单，选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶两种商业用酶，易于工业生产，产率较高，具有一定的抗凝血效果，并为高F值类产品增加了新来源。该方法游离的芳香族氨基酸清除率不太理想，最后得到的寡肽F不是很高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低廉，操作简单，能得到芳香族氨基酸含量低，支链氨基酸保留率高，即高F值的寡肽粗液分离纯化方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

高F值寡肽粗液分离纯化方法，具体步骤为：

预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，按体积比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份为：5~10份柠檬酸、10~18份紫苏提取物、0.1~0.3份氯化钠、0.5~0.8份碳酸氢钠、0.001~0.003份乌索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份维生素E。浸泡，浸泡时间为4~8h。捣碎，过筛，按体积比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为20~25h。过滤，滤渣中按体积比1:2~4加入去离子水，去除油脂，过滤，在42~48℃环境下烘干，得到去脂带鱼粉末；