[发明专利]一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella spp)是一种条件致病菌。也是一种人畜共患病病原菌，对人和动物均有致病性，也是全世界引起人类食物中毒的最主要病原菌之一，主要侵染人的肠道上皮细胞，可以造成各种病症，轻者引起轻度腹泻，重者出现伤寒发热。沙门氏菌的传播主要是通过污染的环境、食物以及饮用水，而且能够长时间存在于环境中，长期保持感染能力，导致其难以彻底净化。准确检测沙门氏菌无论是在动物临床实践还是人类自我保护方面，都具有重要意义。

目前多种沙门氏菌检测技术种类很多，主要包括：传统的分离培养等检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。

传统检测方法主要包括：沙门氏菌分离纯化、生化鉴定和血清型鉴定。传统检测方法中分离纯化和生化鉴定操作虽然简单，但细菌生长较慢，耗时较长；血清型鉴定虽然简便快捷，但是特异性不高，可能会出现交叉反应。分子生物学检测方法包括：PCR检测技术、基因芯片技术、下一代基因测序技术 (Next generation sequencing，又称第二代基因测序)。分子生物学检测法快速、灵敏、特异性强，但成本较高，且要求较高技术水平，大范围应用尚有一定难度。

免疫学检测方法包括：酶联免疫吸附(ELISA)、乳胶凝集试验(Latex Agglutination Test,LAT)等。其中酶联免疫吸附较传统检测方法耗时短可以实现自动化处理大量样品，比培养方法特异性高。但使用多抗血清检测，则特异性不强，如果使用单抗提高灵敏度和特异性，相应抗体的制备要求较高。

乳胶凝集试验是一种间接凝集反应，首先需要将可溶性抗原(或抗体)吸附到乳胶微球表面，该乳胶微球需要具备不溶性和不发生免疫反应等条件，制成致敏乳胶后，在电解质的条件下，与特异性抗体(或抗原)反应会出现肉眼可见的凝集现象。乳胶凝集试验具有高特异性和敏感性，而且操作简单，试验耗时短，适用于临床样本的大量检测。但是乳胶凝集试验存在的缺点为不易找到吸附到乳胶微的特异性和免疫反应性较好的抗原或抗体。

实验室常用的鉴定沙门氏菌的方法为PCR和ELISA。虽然准确率高，但实验条件要求高，且耗费大量时间。因此，迫切需要开发一种快速准确、简便易行的检测方法。

SEN4030是沙门氏菌表达的一段多拷贝蛋白，有5559个氨基酸，在沙门氏菌中具有高度保守性。通过生物信息学分析氨基酸序列发现，SEN4030蛋白跟鼠伤寒沙门氏菌的粘附素蛋白SiiE高度相似，只有76个氨基酸不同，由此推断SEN4030蛋白也应该是一种粘附素类蛋白，在沙门氏菌入侵宿主细胞过程中起作用，可以影响沙门氏菌的致病性。

发明内容

本发明为了克服目前沙门氏菌检测方法难以实现快速准确、简便易行的问题，提出一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法。

SEN4030a蛋白为SEN4030的一部分，其编码基因为SEN4030编码基因中截取的第6600-8100bps序列，约1500bps。通过前期研究，SEN4030a蛋白包含免疫球蛋白样的结构域，可以影响沙门氏菌的致病性，ELISA等相关试验证明有较强的特异性和免疫反应性，可以应用于沙门氏菌特异性诊断。

为此，本发明的具体技术方案如下：

一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法，包括以下步骤：

将SEN4030a蛋白，连接到空白乳胶微球上，制备致敏乳胶微球；

将致敏乳胶微球与待测样品混匀反应，观察凝集结果。

上述检测方法中，所述SEN4030a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述检测方法中，所述致敏乳胶微球的制备方法为：

将预处理后的空白乳胶微球溶液与SEN4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶联1-10小时。

上述检测方法中，所述空白乳胶微球溶液的浓度为0.1-10wt％，所述 SEN4030a蛋白溶液的浓度为0.1-5mg/ml。

上述检测方法中，优选的，在10-40℃下偶联3-7小时，所述空白乳胶微球溶液的浓度为0.1-3wt％，所述SEN4030a蛋白溶液的浓度为0.1-3mg/ml。

上述检测方法中，最优选的，在37℃下偶联5小时，所述空白乳胶微球溶液的浓度为1wt％，所述SEN4030a蛋白溶液的浓度为0.6-0.7mg/ml。

上述检测方法中，所述预处理的方法为：将空白乳胶微球加入去离子水，离心，再加入缓冲液稀释，然后加入Triton X-100。