[发明专利]一种U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR检测方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物检测领域，具体涉及U6、miR 92a及miR 21三种miRNA进行单管三重逆转录的检测方法及逆转录后分别进行单管双重定量的检测方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒包括逆转录茎环引物组、定量检测引物组和定量检测探针组、酶系和PCR反应试剂，使得U6、miR 92a及miR 21的逆转录可在同一反应管中进行，同时，高灵敏和高特异性的定量检测引物序列和定量检测探针及与之相匹配的PCR反应程序和条件，使得miR 21和U6、miR 92a和U6可单管双重定量，避免了现有技术中单管单重定量时的操作误差，使定量更简洁准确。另外，本发明引入Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶扩增方法，提高检测特异性的同时，可耐受更多的模版，检测灵敏度及结果稳定性提高。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及U6、miR92a及miR 21三种miRNA进行单管三重逆转录的检测方法及逆转录后进行单管双重定量的检测方法及试剂盒。

背景技术

微RNA(miRNA)是一类非编码单链小分子RNA，长度为20～24个核苷酸，位于基因组的非编码区，具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。

miR 21是较早发现的人类miRNA之一，在多种生物及哺乳动物多种组织中的广泛存在。大量研究表明，miR 21可作为原癌基因在多种肿瘤中高表达并参与细胞的增生、分化、凋亡等过程，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。因此，检测miR 21的含量对肿瘤的诊断、治疗和预后等具有重要意义。

miR 92a可调控人体细胞中参与细胞分化、凋亡、迁移、免疫等过程中的相关基因表达；另一方面多种肿瘤和疾病，如心血管系统疾病中，存在miR 92a的表达异常情况。因此miR 92a含量可作为一种生物标志物，为相关疾病的诊疗提供参考，检测miR 92a含量具有重要基础和临床意义。

由于miRNA序列短、没有poly(A)尾巴、在细胞内的表达水平比较低，且许多同源miRNA(如let-7家族)序列相似度高，仅差1～2个碱基，使设计的分析探针杂交效率低。为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度，丹麦Exiqon公司的锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)技术被应用于miRNA的分析研究。目前，基于锁核酸(LNA)等技术的支撑，科学家研究出了多种有效的miRNA检测方法，如Northern blotting、微阵列法(miRNA array)、克隆和测序法、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法等。

RT-qPCR更加简单方便，不需标记、操作简单、成本较低、并且灵敏度极高；能在短时间内获得结果，可检测多个miRNA的表达，需要的RNA量较少，因而被广泛用于组织中miRNA表达谱的构建。

目前miRNA逆转录成cDNA的方法主要有三种：引物延伸逆转录法；引物加尾法；茎环引物逆转录法。延伸及加尾两种方法操作简单，一种引物可逆转录多种miRNA，但后续的定量依赖经过修饰的定量引物，特异性不高；茎环引物克服了miRNA序列短的缺点，引入茎环序列，进一步增加了RNA-DNA链互补配对的碱基数，提高了其热稳定性，逆转录效率增加。但逆转录反应后，逆转录酶对后续的qPCR有明显的抑制作用。qPCR采用的信号检测模式主要有两种：SYBR Green荧光染料法和TaqMan探针法，后者特异性更好。

目前，茎环引物逆转录法中，每种miRNA都需要设计一个特异的反转录引物。若需要对样本中的多个miRNA进行定量，逆转录需分管进行，步骤繁琐，从反转录到定量PCR，工作量较大。另外，对miRNA进行定量时，往往需要一个内参基因，单管单重定量时，反应条件不稳定，加样有误差，定量不准确，且耗时耗力，较为繁琐。此外茎环引物及定量引物在同一体系中，引物二聚体严重，易引起过度扩增。

发明内容