[发明专利]一种AAV1病毒介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途

说明书

本发明提供一种肌肉组织特异性表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatec arboxykinase,PEPCK）以降低高血脂、延缓衰老和提高生殖能力的基因表达和转移载体。所述载体含有改造后的人α‑骨骼肌肌动蛋白（α‑skeletal actin）基因的启动子、鼠细小病毒（minute virus of mice,MVM）的内含子、改造后的人PCK1（phosphoenolpyruvatecarboxykinase 1,PCK1）基因的cDNA和4个串联的人miR‑122靶序列。所述重组载体由腺相关病毒载体介导，包括但不限于1型腺相关病毒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种AAV1病毒载体介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途，包含该载体的重组表达单元及基因治疗方式。

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase, PEPCK）是催化糖异生（gluconeogenesis）反应的一个限速酶，即由草酰乙酸和GTP转变为磷酸烯醇式丙酮酸、GDP及CO₂的反应。三羧酸循环是在线粒体中进行，PEPCK则有两种同工酶，分别是在线粒体中的PEPCK-M（mitochondrial form）和在胞浆中的PEPCK-C（cytosolic form）。PEPCK-C基因在人里叫PCK1，在糖异生中有重要作用。目前PCK1已成为肝脏糖异生的第一个明确标志物，肝脏中该基因的转录水平是临床上2型糖尿病评价的重要指标，即如果PCK1的mRNA表达水平增加，糖异生的速率就一定会增加。

PCK1基因编码了一个63kD的蛋白酶，其功能主要有三个方面：在肝脏和肾皮质中表达，催化糖异生反应；在肝脏以及白色和棕色脂肪组织中表达，参与甘油异生反应（glyceroneogenesis）；在流失反应（cataplerosis）中起作用，去除三羧酸循环中的阴离子以便大大增加三羧酸循环的动力学。然而PCK1在不同组织中的转录活性不同。除了主要存在于肝脏中，PCK1同时还广泛存在于哺乳动物的组织内，包括小肠、结肠、乳腺、肾上腺、肺和肌肉，但是在这些组织中的代谢作用还不明确。除此之外，PCK1在不同组织中的主要功能也不同，所以在不同组织中特异性条件敲除或过表达PCK1将引起多种不同的表型。正常情况下，PCK1在骨骼肌中不表达或表达量很低。PCK1用6个ATP的能量来催化丙酮酸转变为一个葡萄糖，而在骨骼肌的无氧酵解过程中，每分解一个葡萄糖却只能生成2个ATP。甘油三酯在骨骼肌中的含量与PCK1成正比，是主要的能量来源。

在肌肉中过表达PEPCK-C的转基因小鼠（PEPCK-C^mus）有着令人兴奋的表型。首先，PEPCK-C^mus转基因小鼠的运动能力远远高于对照小鼠，能以20米/分钟的速度跑5公里，而对照小鼠在同样速度下只能跑0.2公里，这可能与骨骼肌里甘油三酯的增加有关。其次，PEPCK-C^mus转基因小鼠的寿命远远长于对照小鼠，而且在30-35个月时还能产下正常的小鼠后代，大多数小鼠在12-18个月就失去生殖能力了（Hakimi P1, Yang J, Casadesus G, etal.Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in the mouse.J BiolChem. 2007;282(45):32844-32855.）。

在骨骼肌中过表达PEPCK-C的转基因猪也得到了和小鼠类似的结果。得到了一种和顶级牛肉特性类似的、低脂肪含量高肌间脂肪含量的猪肉，在肉质和口感上获得大幅度提升，具有巨大的经济价值。并且PEPCK-C转基因猪在繁殖能力上有所提高，因此在优良品种的繁殖上有着广泛的应用前景。