[发明专利]一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖氧化酶突变体GODB及其编码基因与应用。本发明提供的葡萄糖氧化酶GODB突变体以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作为母本，经点突变Glu82Cys而获得。本发明提供的突变酶酶活力由野生型的229.6U/mg提高到了352.1U/mg，提高幅度为53.3％；在60℃下的半衰期由野生型的51min提高到了119min，提高幅度为133％；因此，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体GODB能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和遗传工程领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)又称为β-d-葡萄糖氧化还原酶，EC号为1.1.3.4，能专一的作用于β-d-葡萄糖的羟基，使其脱氢被氧化为羧基或者醛基，生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。由于GOD具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功效，被广泛的应用于食品、医药、饲料、纺织等工业中。例如，在食品工业中，GOD有效去除葡萄糖可抑制食品发生褐变，而且产物过氧化氢是一种杀菌剂，可延长食品的货架期；在医药行业中，利用GOD的底物特异性，可应用于人体生化指标中葡萄糖的定量测定，操作简易、省时省力。在饲料行业中，GOD在反应过程中消耗了胃肠道中的氧气从而形成一个厌氧环境，在促进厌氧有益菌生长的同时抑制了好氧菌和不耐酸病原微生物的存活，从而有效提高动物免疫力；在纺织工业中，利用反应产物过氧化氢对纺织物进行漂白处理，可有效降低生产成本、提高纺织品的质量。

目前，工业化生产GOD的菌株主要来源于黑曲霉和青霉。相对而言，黑曲霉产的GOD热稳定性较好，而青霉产的GOD酶活较高。传统生产GOD的方法主要集中于利用紫外诱变或者化学诱变剂诱变的方法获得高产菌株，并对菌株培养的发酵条件进行优化以进一步提高菌株的产酶能力。但是，黑曲霉和青霉的发酵过程相对复杂、并伴随有产量较低、发酵产物不均一等特点，给后期加工工艺带来了困扰。因此，近些年研究者选择利用基因工程手段来改良和提高GOD的生产。目前已成功实现异源表达的系统有毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌及木霉等。尽管利用基因工程的手段实现了GOD的异源表达，由于表达量不高导致生产成本突出的问题仍然没有得到有效解决，阻碍了GOD的大规模工业化生产及应用。所以，利用蛋白质工程的手段对GOD进行分子改良以提高其催化性能是目前的主要研究思路。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白，以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GODA作为母本，经点突变Glu82Cys，而获得的葡萄糖氧化酶GODB突变体，本发明所述蛋白是如下1)、2)、或3)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列中的第82位半胱氨酸保留不变且将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且酶活和热稳定性均较野生型酶增强了的由1)和/或2)衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由581个氨基酸残基组成。

上述1)、2)、或3)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组异源表达得到。上述1)、2)、或3)所述的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1所示DNA序列缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。