[发明专利]微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法

说明书

本发明涉及用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：将BHK21细胞复苏，采用低血清培养基进行微载体培养，然后以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，使细胞密度维持在1.5～3×10⁷个/ml时接毒，48h后收获病毒液，连续收获6天，将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品疫苗。所述的疫苗效价高，具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。

背景技术

猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。

目前尚无治疗猪伪狂犬病的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得，其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状表明使用的PRV Bartha-K61株疫苗免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRV HeN1株，该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击。

伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素，是伪狂犬病毒的主要毒力相关基因。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要的意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。

目前对猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是针对如何构建和筛选伪狂犬病病毒基因缺失的毒株，而对相应毒株的扩大培养条件没有进行深入的研究，大部分是采用常规的培养条件，如公开号为CN 1244692C的中国专利申请“一种伪狂犬病TK^-/gE^-/gI^-基因缺失标志活疫苗及制备方法”，将构建的基因缺失伪狂犬病病毒株采用原代鸡胚成纤维细胞进行转瓶培养，不仅不易转染，易引入污染，且规模较小，不适合疫苗的大规模生产。

微载体反应器培养是贴壁细胞进行大规模培养的常用手段，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易，在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。目前，我国应用于细胞培养生产病毒疫苗的商品化微载体主要有：GE公司的CytodexⅠ、CytodexⅡ、CytodexⅢ和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、Biosilon、Cultispher G等，价格昂贵，导致病毒疫苗生产的成本大大增加。因此，有必要提供一种成本较低，且可大规模生产高病毒滴度的猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，以充分实现猪伪狂犬gE基因缺失病毒低毒，免疫原性强的价值。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。

本发明提供的技术方案为如下：

一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：