[发明专利]一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用

权利要求书

1.一种ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。

2.一种如权利要求1所述的ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）将SEQ ID NO:1所示的基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）中，插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间，得到重组质粒pET28a/ZmEDS；

2）对pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变，分别制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS- V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒；分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQ ID NO:3-6所示；

3）将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS- G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同时加入25 μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，其中，重组质粒各100-150ng，冰浴20 min，42℃热激1 min20 s，冰上冷却2 min后加入液体LB培养基200 μL，37℃ 200 rpm下复苏1.5 h，再涂布于含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天划线取平均菌落，置于同时含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的5 mL液体LB培养基中，37℃ 200 rpm过夜培养；制备得到上述五种菌种，菌种为大肠杆菌BL21背景株系，且每个菌种分别含有两种质粒：

①pMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；

②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；

③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；

④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；

⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；

次日取2 mL上述菌种置于50 mL NZY液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37°C200 rpm培养，菌液培养至A₆₀₀达到0.8-1.0，向其中加入1 M的IPTG终浓度至1 mM，然后将菌液转至16 °C，200 rpm诱导培养24 h；之后用等体积的正己烷萃取萜类产物，16°C 200 rpm萃取30 min；振荡充分后，取出静置，取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL，转移至GC样品瓶中，用于GC-MS检测，制备得到倍半萜类化合物。