[发明专利]利用GST表达体系制备抗人PIAS3高效价抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-PIAS3 87-121aa(amino acid)融合蛋白的多克隆抗体及应用。

背景技术

PIAS3是信号转导和转录激活因子3(STAT3)的抑制蛋白,能够特异的与活化的STAT3结合进而阻止STAT3与DNA结合。hPIAS3全长定位于人类第1号染色体1q21上，包含14个外显子。

PIAS3在人类正常组织广泛表达，而对于癌组织中的表达目前的研究结果有一定的争议性。对来源于人体脑、乳腺、肾、肺、前列腺、皮肤、肝脏、食管、胃和结直肠10个部位的103例恶性肿瘤标本的研究发现，与正常组织相比，PIAS3蛋白在其中100例(大约97％)中都有程度不同的高表达。而另外一些实验组的研究表明PIAS3在胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和子宫内膜癌等癌症中均表达减少或缺失。这种争议性是否由于对不同剪接型PIAS3蛋白检测的结果，值得深入研究。抗体是蛋白质检测和功能研究中的最有力工具之一，我们制备的针对PIAS3 Exon2特异表达肽段的高效价抗体对于系统研究68KD PIAS3全长蛋白在各种组织和细胞中的表达和作用机制具有十分重大的意义。另外，研究表明PIAS3蛋白能够诱导前列腺癌凋亡，是前列腺癌抑癌蛋白，我们制备的抗体为PIAS3潜在分子机制的研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于表达PIAS3 Exon2特异肽段蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究PIAS3功能及相关疾病提供必要的实验工具。

利用基因工程技术，将PIAS3 Exon2特异表达肽段87-121位氨基酸(35aa)对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫印迹和免疫组化检测了PIAS3蛋白在前列腺癌细胞和前列腺癌组织中的表达与定位。

本发明的GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白是将利用特殊序列(PIAS3 Exon2特异表达肽段87-121位氨基酸对应DNA片段)构建GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白，这段87-121位氨基酸序列为：

其对应核苷酸序列为：

这种GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：

第一步，克隆载体的构建

以人PIAS3 cDNA为模板，应用PCR技术,扩增得到的目的片段与pMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得PIAS3基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。

第三步，GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的诱导表达和纯化

重组质粒PGEX-4T-1/PIAS3 Exon2 35aa转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。

第四步，兔抗PIAS3 Exon2 35aa抗血清的制备及纯化