[发明专利]利用GST表达体系制备抗人PIAS3高效价抗体及应用

权利要求书

1.利用GST表达体系制备的抗人PIAS3 Exon2 35aa高效价抗体，其特征在于利用GST表达体系以人PIAS3 87-121位氨基酸对应DNA片段作为特异序列，制备的GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白作为抗原免疫新西兰家兔产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-PIAS3 Exon2 35aa抗体的滴度高达1∶1000000，并经过Western blot鉴定该抗PIAS3 Exon2 35aa抗体具有较好的特异性，其中，87-121位氨基酸序列为：

其对应核苷酸序列为：

1 gtaggctccc ctggtcctct agctcccatt cccccaacgc tgttggcccc tggcaccctg

61 ctgggcccca agcgtgaggt ggacatgcac ccccctctgc cccag。

2.如权利要求1所述的原核表达GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白，再经免疫新西兰家兔获得抗GST-PIAS3 Exon2 35aa抗血清，具体包括五步：

第一步，PCR-pMD18-T/PIAS3 Exon2 35aa重组质粒的构建

PIAS3mRNA序列从Genebank得到，基因序列号为NM_006099。以cDNA为模板，上游引物：5’-GAATTCGTAGGCTCCCCTGGTCCTCTAGCTCCCATTCCCCCAACGCTGTTGGCCCCTGGCACCCTGC(含EcoRI酶切位点)；下游：5’-CTCGAGTCACTGGGGCAGAGGGGG(含XhoI酶切位点)，扩增得到的片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp⁺琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和SalI单酶切鉴定；

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建

将含有PIAS3基因2号外显子87-121氨基酸对用的cDNA片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒获得PIAS3基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的PIAS3基因2号外显子87-121氨基酸对应的核苷酸片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；

第三步，GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的诱导表达和纯化

重组质粒PGEX-4T-1/PIAS3 Exon2 35aa转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Amp⁺培养基中，37℃振摇培养过夜。次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp⁺的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌,再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl，pH＝8.0)洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍，收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物；

第四步，兔抗PIAS3 Exon2 35aa抗血清的制备及纯化

以纯化的PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2周后进行第1次加强免疫，300μg纯化的PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2周加强免疫1次，于末次免疫后1周后取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶1000000时，颈动脉放血，收集血清，将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定；

第五步，PIAS3 Exon2 35aa抗体的免疫学检测

用GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-PIAS3 Exon2 35aa抗体先稀释10倍再倍比稀释后采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Western blot方法分析PIAS3 Exon2 35aa抗体特异性，将纯化的融合蛋白GST-PIAS3 Exon2 35aa样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗PIAS3 Exon2 35aa抗体，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。