[发明专利]一种牛副流感3型病毒3种基因型多重RT-PCR检测方法

说明书

根据Genbank上发表的牛副流感3型病毒（Bovine parainfluenza 3 virus，BPI3V）3种基因型分离株的HN基因进行序列比较分析，参考3个基因型分离株NM09、TVMDL15、SD0835各自的HN基因序列保守区设计特异性引物，建立了在同一体系内检测BPI3V的3种基因型的多重RT‑PCR方法。方法可同时检测出A型BPI3V长度为150bp、B型BPI3V长度为253bp和C型BPI3V长度为342bp的特异性片段，且最低阳性质粒检测分别为0.89×10⁴copies/µL、0.92×10⁴copies/µL、1.53×10⁴copies/µL，具有良好的稳定性和特异性。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及病毒性传染病的检测方法，特别是涉及一种牛副流感3型病毒3种基因型的检测方法及应用领域。

背景技术

牛副流感是由牛副流感3型病毒引起的一种急性、接触性传染病，以呼吸道症状为主，单一病毒感染症状较轻，混合感染其他病毒细菌或在应激因素的作用下会引起严重的临床症状甚至导致病牛的大量死亡。牛副流感3型病毒（Bovine parainfluenza 3 virus ，BPI3V），是副黏病毒科呼吸道病毒属的单股负链RNA病毒，基因组由约15000多个核苷酸组成，至少编码6种结构蛋白。该病毒目前分为BPI3V基因A型、BPI3V基因B型和BPI3V基因C型3个基因型。牛副流感3型病毒自1959年被美国的Reisinger等从犊牛肾脏中首次分离之后，陆续被世界上许多国家分离。国内首次关于BPI3V的报道是在2001年童泽恩等对有呼吸道症状死牛剖检后发现疑似牛副流感。我国牛群中第一次被分离到BPI3V是在2009年，由刘鹏等分离内蒙分离株(NM09)并在2012年由中国学者Wen等鉴定为BPI3V基因A型，中国学者Zhu等分离并鉴定出BPI3V基因C型山东分离株(SD0835)。我国目前没有分离到BPI3V基因B型。到目前为止，国内外许多学者都建立了针对检测BPI3V的RT-PCR方法，但没有针对BPI3V的3种亚型的RT-PCR检测方法。随着国内外对BPI3V的广泛研究，越来越多地区被发现有BPI3V的流行，而近几年我国多个省份的血清学调查也显示牛副流感3型病毒抗体阳性率较高，其中内蒙古血清阳性率达84.31%（霍志云，2012）和95.20%（张欣欣，2016）。鉴于内蒙古部分地区牛副流感血清学调查阳性率高，但对其病原学调查尚不充分。同时多重RT-PCR以其操作简便、快速的优点常用于临床实践。本研究以建立了BPI3V的HN基因为靶序列，建立了检测BPI3V和区分其3种基因型的多重RT-PCR检测方法。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。

发明内容

根据Genbank上发表的BPI3V的3种基因型分离株NM09（登录号：JQ063064)、TVMDL15（登录号：KJ647284)、SD0835（登录号：HQ530153)各自的HN基因进行序列比较分析，设计了3对特异性引物，建立了检测BPI3V的3种基因型的多重RT-PCR检测方法，从而实现对BPI3V的高效、快速、准确检测分型。

本发明的目的在于除通过多重RT-PCR方法可用于BPI3V的临床检测，还能同时鉴别检测BPI3V的3种基因型。

本发明的目的在于提供一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的引物，所述引物如表一所示。

本发明的目的在于提供一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的试剂盒，所述试剂盒包括检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的引物。

本发明具体提供了一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型检测方法，具体步骤如下。

1.引物和探针的设计与合成：