[发明专利]一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法

说明书

本发明公开了一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法，步骤是：1）RAD测序技术扫描大鲵雌雄基因组池与数据分析：通过基因组DNA提取，酶切，建库，测序获得大鲵雌雄基因组RAD数据，对雌雄基因组RAD数据进行分析，获得雌雄特异候选RAD数据；2）候选雌性特异片段的验证：挑选雌性特异候选片段并设计引物，以DNA为模板进行PCR扩增，将能扩增出预期大小片段，只有雌性个体有特异条带，雄性个体无条带为特异标记；3）雌性特异片段的序列分析：将特异片段克隆到PMD‑18T载体中，连接、转化后用常规方法检测阳性克隆，送样测序，同源性达到96%。方法准确、易行、价格低廉且操作简便，解决了目前生产上对大鲵性别鉴定的难题。

技术领域

本发明属于中国大鲵分子标记和遗传性别鉴定技术领域，更具体涉及一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法,它适用于在大鲵繁育及性控育种中应用的遗传性别鉴定。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus)别名“娃娃鱼”，是全球现存最大的淡水两栖动物。上世纪八十年代， 野生大鲵被列为国家Ⅱ级重点保护有尾两栖类动物（叶昌媛 等，1993）。此外，中国大鲵也是一种食用与药用价值极高的经济动物，风味独特，具有滋阴补肾、补血行气的功效（张神虎, 2001），被誉为“水中人参”（侯进慧 等, 2004）。为保护和利用大鲵资源，国内科技工作者开始探索大鲵人工繁殖技术，通过近30余年的探索研究，大鲵人工繁殖已取得初步成功（刘鉴毅 等，1999）。近年来，随着大鲵人工繁育技术的不断成熟与完善，大鲵养殖业也应运而生，并逐渐向规模化、集约化发展，成为一项新兴养殖业。2006年我国人工养殖子二代大鲵合法商品化出售这一法令的颁布也进一步加快了大鲵养殖业的发展。为进一步促进产业发展与物种保护，自2015年6月1日起，农业部建立大鲵标识管理制度和可追溯体系，取消《经营利用许可证》与《运输许可证》，该法令的颁布为大鲵的经营与运输提供了更加便捷的方式。然而，要做好大鲵的人工繁育工作，亲本培育是所有环节中的重中之重，因此，如何区别大鲵亲本性别进行针对性培养显得尤为重要。此外，参繁亲本需要合理的性比搭配，并且注射催产剂时，雌雄亲本剂量与效应时间各不相同。大鲵进行性别鉴定是一个公认的难题，而对接近繁殖期大鲵性别鉴定主要有以下一些方法：大鲵头部来进行雌雄区别（欧东升 等 2007），行为学上对大鲵性别进行区分（梁刚 等，2010），还有些学者，通过观察大鲵泄殖孔的特征来鉴别性别，还有利用超声技术鉴定大鲵性别（雷宇杰，2016）。以上方法准确率不高或是实际操作中难度较大，价格昂贵。因此，如果能准确而又简单鉴定大鲵的性别将会对大鲵繁殖工作提供巨大帮助，进而提高大鲵产量，带来巨大的经济效益。

简化基因组测序技术（Restriction association site DNA, RAD-seq）是一种利用酶切技术、序列捕获芯片技术或其他实验手段降低物种基因组复杂程度，进而研究基因组各类遗传结构性变异的技术手段。利用简化基因组测序筛选性别特异标记已在多个物种研究中被采用。如Gamble 利用RAD测序筛选到黄黑平鲉（Sebastes chrysomelas）与肉色平鲉(Sebastes carnatus) 性别特异标记（Gamble， 2016）。Gamble与Zarkower采用RAD测序序列与基因组序列比对筛选到绿安乐蜥（Anolis carolinensis），牙买加灰蜥蜴（Anolis lineatopus）与棕安乐蜥(Anolis Sagrei)雄性特异特异分子标记（Gamble and Zarkower，2014）。Kafkas 等利用RAD测序，发现33757个候选性别特异SNP标记，选取其中38个进行验证，8个为性别特异标记，并推出阿月浑子（Pistacia vera L.）为ZZ/ZW性别决定型（Kafkaset al., 2015）。

发明内容