[发明专利]基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用

说明书

发明提供了一种生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体包括探针；所述探针的核苷酸序列为S‑SDZ No.1。本发明提供的试剂盒及方法具有检测快速、稳定、简单等优点，制得的核酸适体对SDZ残留检测快速、灵敏度高、重复性好，特异性高，在食品安全快速检测中有广阔应用前景。

技术领域

本发明属于生物学与食品安全分析领域，具体涉及一种磺胺嘧啶残留的生物传感探针及其检测试剂盒制备方法和应用。

技术背景

兽药滥用和违禁使用的现象愈演愈烈，其残留不仅直接影响人类的身体健康(致癌、致畸、致敏、神经毒性)，诱导某些菌种产生耐药性，给人类生态环境造成严重的危害。磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)是人工合成的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制作用。由于该类药物对于动物疾病的预防、治疗具有较好的效果，因而在畜牧业生产中被广泛应用。SDZ抗生素的不合理使用而导致其在动物源性食品中残留，通过食物链进入人体，对人体产生一定的毒副作用，具有潜在的致癌性。为了保障动物用药安全性和有效性，以及人类摄食动物性食品后的安全性，很多国家制定了抗生素的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。加拿大、美国、欧盟规定了动物源性食品中磺胺类抗生素总量的最大残留量为0.1mg/kg。我国规定动物性食品中SDZ的MRLs为0.1mg/kg。因此，为了提高动物源食品的安全性，建立高灵敏、高选择的磺胺类抗生素检测方法迫在眉睫。

常规检测SDZ残留的方法有高效液相-质谱联用、气相色谱-质谱联用、薄层色谱法和毛细管电泳法，这些仪器检测方法虽然准确，但样品前处理繁琐、试剂消耗量大、检测时间长、设备昂贵、需专业技术人员进行操作、不适合进行现场快速检测和大量样品的筛选，难以满足高通量多残留快速检测的需要。基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析方法，由于灵敏度高、操作简便、成本低且适合现场快速检测而越来越受到重视。但针对SDZ靶标的抗体需要一系列繁琐复杂的动物体内筛选过程，实验周期长，成本高，同时抗体容易变性，对检测环境的要求很高。抗体的制备过程不仅需要使用实验动物，且制备出的抗体很难被重复生产，批间差异明显。因此，亟需开发灵敏、特异、快速的新型靶标识别元件用于磺胺类等抗生素的检测。

适配体(Aptamer)作为一种抗体的替代物，由于其具有靶标范围广，亲和力强，结合强度高，特异性好，制备、修饰方便快速等优点，为抗生素等靶标的特异性检测开辟了新的途经。适配体是一类在体外通过指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选出的能与各种目标分子高亲和、高特异结合的单链DNA或RNA片段，可以通过自身折叠形成二级或三级结构使其对特定靶标(如金属离子、小分子、蛋白、细胞等)有很强的亲和力，作为分子识别的元件，而广泛应用于医学临床诊断和治疗。在农产品及食品质量安全领域，已筛选到了针对真菌毒素、重金属离子、农药残留、兽药残留等污染物的适配体，建立了基于核酸适配体的检测方法。

经过对现有技术的检索发现，倪娟佳在《学位论文》公开了“恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选及化学发光检测方法的研究”，筛选出能特异性识别SDZ的核酸适配体，并分别建立了用于牛奶中磺胺二甲嘧啶残留检测的直接竞争化学发光分析方法。结果：其对磺胺二甲嘧啶检测限为0.92ng/ml，IC₅₀为5.61ng/ml，线性范围为1.85-21.57ng/ml。该检测限明显低于目前国家限定的SDZ残留量。但该适配体特异性高，SDZ没有交叉反应。并且该基于适配体的检测方法主要是针对比较简单生物基质的检测，而鸡肉、鸡蛋等复杂基质成分的动物源性食品中若富含盐离子(Na⁺或K⁺)，将可能显著改变反应体系的离子浓度，使得该核酸适配体无法折叠成正确构型，将直接导致核酸适配体无法与靶标结合，从而导致检测方法的失败。使得上述化学发光适配体分析方法应用于动物源性食品临床样品检测时受到了极大限制。