[发明专利]基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体的核苷酸序列为序列表记载的SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体由单链DNA组成，且3'末端或5'末端标标记有生物素。

3.根据权利要求1所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体的制备方法包括如下步骤：

1)将磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶分别和羧基琼脂糖磁珠偶联；分别将磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶经活化氨基后，取羧基琼脂糖磁珠与活化的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶溶液混合，进行偶联反应；分别获得磺胺嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物、磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物；

2)单链DNA文库与相应引物准备：随机文库为全长96bp的单链DNA文库的核苷酸序列为SEQ ID No.2，其中，N60为60个碱基的随机序列；上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4；

3)SELEX筛选磺胺嘧啶核酸适体；

4)克隆测序获得生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体。

4.根据权利要求3所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述SELEX筛选磺胺嘧啶核酸适体的步骤为：

1)文库变性：将溶解的上述ssDNA文库置于95℃水浴中放置10-20min；

2)反筛：取磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物，与变性的文库混合，室温孵育，反应完毕，离心，保留上层清液，得到反筛未结合文库；并且第一轮不做反筛；

3)正筛：取磺胺嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物加入上一步骤得到的反筛未结合文库，在室温孵育，反应完毕，离心并弃去上层清液，得到正筛未结合文库；

4)洗提结合DNA：将上一步骤得到的正筛未结合文库用NaOH洗提6次；

5)纯化洗提的DNA：用NAP-5寡核苷酸纯化柱子对NaOH洗提液进行回收纯化，以去除NaOH及其他杂质，得到的筛选产物DNA溶液即为筛选一轮的适体，一轮筛选完毕；

6)以筛选适体DNA为模板，通过对称PCR、链酶亲和素琼脂糖珠等技术获得大量的DNA，为下一轮筛选做准备；

7)重复上述步骤1-6，共筛选7轮。

5.一种基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体的稀释液和辣根过氧化物酶标记磺胺嘧啶亲和素稀释液。

6.权利要求5所述基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)取链霉亲和素溶解于PBS中，37℃放置1小时；加入戊二酸溶液，混匀；4℃放置2小时，将反应液全量加至处理好的透析袋中，透析；将透析好的链霉亲和素戊二酸复合物用包被缓冲液液稀释1mg/mL,取稀释好的链霉亲和素戊二酸复合物加至酶标板，每孔200μL，混匀，37℃包被过夜；包被酶标板洗涤4次后备用；

2)将预处理25μL生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体探针、25μL磺胺嘧啶-辣根过氧化物酶、50μL不同浓度磺胺嘧啶标准品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽；37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线；

3)测试待检样品过程，重复上述步骤2)：将预处理25μL生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体探针、25μL磺胺嘧啶-辣根过氧化物酶、50μL待测组织处理样品混合均匀，37℃

孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽；37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，与标准曲线比较，得到待测试样中磺胺嘧啶的含量。