[发明专利]一种特异性检测人类微小病毒B19核酸的荧光PCR方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物体外核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测人类微小病毒B19核酸的荧光PCR方法和试剂盒，能够对人类微小病毒B19核酸进行定性检测，可以作为有效的检测工具。

背景技术

人类微小病毒B19(human parvovirus B19，简称B19),属细小病毒科，红病毒属，单链DNA病毒，全长约5.6-kbp，是细小病毒中唯一对人类有致病性的病原体。B19病毒感染普遍存在，在不同年龄和免疫状态的人群中临床表现不同，常通过呼吸道、密切接触和宫内感染，也可通过输血和血液制品传播，以及血胎途径垂直传播，可引起儿童及成人的无症状感染、传染性红斑和关节炎，也可引起溶血性贫血患者一过性再生障碍性贫血危象和免疫缺陷患者的慢性贫血，有时引起血小板减少和血管性紫癜。其临床表现广泛而复杂，尤其是妊娠期妇女B19病毒宫内感染可导致胎儿水肿、流产、甚至死胎等情况，是需重点解决的问题。

临床实验室检测多采用血清学试验，如ELISA、RIA和IFA等，检测特异性抗体。血清B19病毒-IgM阳性证明近期感染己持续2～4个月。血清B19病毒-IgG阳性则提示既往感染。由于B19病毒抗原来源困难，血清学试验尚难普及，而且某些人群感染病毒后抗体反应很弱或不产生抗体，因此仅以抗体检测结果不能准确判定B19病毒感染情况，需辅以抗原或核酸检测结果作为诊断和治疗的依据。目前比较成熟的核酸检测方法是用荧光PCR方法，该方法克服了常规PCR法特异性差、易污染、结果分析操作步骤多等缺点，采用TaqMan方法或称双标探针法(荧光淬灭探针或称FQ探针)，即在其5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用，设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火，由三个寡核苷酸共同结合于目的基因片段，使其特异性大大增强。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性分析。该PCR反应在封闭系统内进行，分析结果也无需开封，因此，避免了PCR产物污染的发生。

目前，也有荧光PCR方法用于检测人类微小病毒B19的报道，但是开发更多有效、快速、准确、灵敏度高、特异性强的荧光PCR方法用的引物和探针，并将此引物和探针用于检测试剂盒也是本领域追求的目标。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性检测人类微小病毒B19核酸的荧光PCR方法及试剂盒，该试剂盒具有灵敏、特异、反应效率高的特点，能够实现定性检测人类微小病毒B19核酸的目的。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种特异性检测人类微小病毒B19核酸的荧光PCR试剂盒，包括特异性引物对和探针，所述的特异性引物对为：

正向引物：5’-GCCGTGTGCACCCATTGTA-3’；

反向引物：5’-GGGCGTTTAGTTACGCATCCT-3’；

所述的探针为：5’-ACTCCCCACCGTGCCCTCAGC-3’。

本发明中，所述的探针的5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记淬灭基团。

具体地，所述的报告荧光素或荧光染料为FAM或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料；淬灭基团为TAMRA或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质。

优选地，其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料例如HEX、TET、JOE、Yakima Yellow、Cy3、Cy3.5、Cy5、NED、VIC、PET、ROX、LIZ、RED、Texas Red；其它任何可以作为淬灭基团的化学物质例如Dabcyl、BHQ1、BHQ2。

优选地，所述的试剂盒还包括阳性质控品，所述阳性质控品含人工合成序列，所述的人工合成序列为人工合成含所述B19病毒特异性引物对扩增产物片段的序列。该人工合成序列的内容为：

GGTCATTTACCATATGTACTATATGACCCTACAGCTACAGATGCAAAACAA

CACCACAGACATGGATATGAAAAGCCTGAAGAATTGTGGACAGCCAAAAGC

CGTGTGCACCCATTGTAAACACTCCCCACCGTGCCCTCAGCCAGGATGCGT