[发明专利]冠心病遗传风险因子检测试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种检测冠心病易感性的方法及试剂盒，更具体的说是通过测定与冠心病相关基因KRIT-1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)预测受试者对于冠心病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于分子生物学和医学领域。

【背景技术】

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。大量的流行病学调查研究表明血浆同型半胱氨酸水平升高与动脉粥样硬化性血管疾病危险增加有关，且血浆同型半胱氨酸与动脉粥样硬化性血管疾病之间存在着一种强烈的剂量依赖关系，这种关系不依赖于传统的致动脉粥样硬化性血管疾病的危险因子。在正常情况下人体内，血浆同型半胱氨酸的生产和代谢保持平衡。各种原因造成血浆同型半胱氨酸生成增多或代谢障碍，均会使血浆同型半胱氨酸在体内蓄积，形成高同型半胱氨酸血症。造成高半胱氨酸的原因基本上分为遗传性代谢和获得性代谢障碍两大类，其中一类是遗传因素，主要是血浆同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶发生基因突变，导致酶活性下降，使甲硫氨酸代谢障碍，导致血浆同型半胱氨酸在体内蓄积。

目前研究中，KRIT-1是微管结合蛋白，能在有丝分裂时增强微管正端的定位，在微管趋向运动中有潜在的作用，KRIT-1的粘附提供了内皮管腔形成的必要信号，提供了细胞-细胞接触，细胞-基质相互作用，形成细胞骨架结构信号通路，DRIT1基因的突变造成蛋白功能的丢失将会使血管出现问题，成为重要的心脑血管致病因素。

综上所述，为了最终实现治疗冠心病，本领域迫切需要寻求冠心病遗传风险因子，并开发检测冠心病遗传风险因子的方法以及试剂盒。

【发明内容】

本发明的另一目的是提供一种用于检测冠心病易感位点的试剂盒，该试剂盒包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析，本发明操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测冠心病易感位点的试剂盒，对KRIT-1基因外显子中包含rs562385968位点的区域进行扩增及HRM技术分析。

进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增KRIT-1基因中包含rs562385968位点的区域的特异性引物。

进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步的，试剂盒的组分及含量包括5ul 2X LightCycler 480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul 25mM MgCl2溶液、1ul 2μM Primer Mix、1ul 5ng/μl左右DNA、1.8ul H2O、具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的特异性引物。

本发明试剂盒的使用方法包括步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的KRIT-1基因外显子中包含rs562385968位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点rs562385968的基因型。

进一步的，KRIT-1基因的rs562385968位点的基因型带有TT时，该KRIT-1基因所属样品的测试者对于冠心病的易感性高于基因型没有TT的测试者。

进一步的，使用特异性引物扩增样品的KRIT-1基因中包含rs562385968位点的区域，该特异性引物是指针对KRIT-1基因上rs562385968号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。

进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。

进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。

进一步的，所述冠心病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测冠心病的易感性的应用。

进一步的，所述试剂盒在预测冠心病易感性方面的应用。

进一步的，所述方法及试剂盒在检测冠心病遗传风险因子单核苷酸多态性位点方面的应用。