[发明专利]一种金磁纳米颗粒的制备及其结合表面增强拉曼光谱法快速检测河豚毒素

权利要求书

1.一种Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法，包括如下步骤：

(a)拉曼光谱基底制备

将Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒与NHS-PEG-NHS在pH＝7.4磷酸盐缓冲液中反应，再与河豚毒素抗体反应得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体；所述NHS-PEG-NHS的质量用量以Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒的体积计为1mg/mL～1.5mg/mL；所述河豚毒素抗体的用量以Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒的体积计为0.1mL/mL～0.2mL/mL；

将罗丹明B拉曼染料与河豚毒素抗体在pH＝8.3的NaHCO₃缓冲液反应得到RhB修饰后的河豚毒素抗体；所述罗丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗体的体积用量计为0.50mg/mL～0.55mg/mL；

(b)建立水中河豚毒素检测的工作曲线

金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体与RhB修饰后的河豚毒素抗体混合后磁分离去除上清液，并转移至凹面载玻片上，所述RhB修饰后的河豚毒素抗体与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体的体积用量比为1:5～10；通过激光拉曼光谱仪直接照射得到空白对照的拉曼光谱图；

取与上述步骤等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体，与河豚毒素配制成具有梯度的0.01～0.5μg/mL浓度范围的河豚毒素溶液，测量其拉曼光谱图，与罗丹明RhB的拉曼光谱图比较得河豚毒素存在时，RhB有1510cm^-1的特征峰，以1510cm^-1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图，获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线；

(c)水中河豚毒素样品的检测

将样品与步骤(b)中等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体配置成溶液，测量其拉曼光谱图，如出现1510cm^-1处的RhB特征峰，读取其峰强，代入步骤(b)中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度，即可计算出样品中河豚毒素的浓度；如未出现1510cm^-1处的RhB特征峰，说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在；

所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒按以下方法制备：先以Fe₃O₄纳米颗粒为起始物，加入TEOS在Fe₃O₄表面形成SiO₂外壳，再加入APTES以及MPTES对SiO₂外壳表面进行功能化，得到表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒；同时用柠檬酸钠还原HAuCl₄溶液得到粒径均匀分布的Au纳米颗粒；将Au纳米颗粒加入所述表面带-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂纳米颗粒，通过-NH₂的静电吸附和Au-S键的作用进一步将Au纳米颗粒致密地组装在Fe₃O₄/SiO₂表面，形成具有核壳结构的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁纳米颗粒，再加入TEOS和APTES，最终得到所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为：

(a)称取1mg NHS-PEG-NHS,溶于1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，与1mL Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁纳米颗粒混合，振荡反应6h，反应结束后磁分离收集颗粒，用PBS洗涤金磁纳米颗粒，再次磁分离；用2mL PBS将收集到的颗粒分散，加入0.1mL 1mg/mL河豚毒素抗体溶液，室温下振荡反应6h；反应结束后保存在4℃冰箱中备用，得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体；

取50μg罗丹明B拉曼染料溶于0.2mL pH＝8.3的NaHCO₃缓冲液中；再加入0.1mL 1mg/mL的河豚毒素抗体；混匀后室温下振荡反应6h；反应结束后用NaHCO₃缓冲液透析混合液，除去多余的罗丹明B拉曼染料，得到RhB修饰后的河豚毒素抗体；

(b)取金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50μl和RhB修饰后的河豚毒素抗体10μL，与河豚毒素配制成浓度为0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL时的拉曼光谱图，以1510cm^-1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图，获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线；TTX浓度在0.5μg/mL至0.01μg/mL范围内，1510cm^-1处拉曼峰强的对数与河豚毒素浓度的对数线性关系良好，线性方程为InI₁₅₁₀＝9.34725InC_TTX+0.89229，其中lnI₁₅₁₀为1510cm^-1处拉曼峰强的对数，lnC_TTX为河豚毒素浓度的对数，R＝0.9959；

(c)将样品与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50μL和RhB修饰后的河豚毒素抗体10μL配置成溶液，测量其拉曼光谱图，如出现1510cm^-1处的RhB特征峰，读取其峰强，代入步骤(b)中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度，即可计算出样品中河豚毒素的浓度；如未出现1510cm^-1处的RhB特征峰，说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。