[发明专利]一种检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，以及基于微流控芯片系统的检测呼吸道病原体的试剂盒及其方法。

背景技术

呼吸道感染是我国常见的一种传染病，是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。上呼吸道感染主要有病毒引起，指鼻腔、咽或喉部炎症，最常见的是急性上呼吸道感染，有较强的传染性也可引起严重并发症。下呼吸道感染由病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物引起，下呼吸道感染包括支气管炎、肺炎等，治疗时若能明确引起感染的病原体，则可以选择有效的抗生素或抗病毒治疗。同时现今非典型呼吸道病原体在呼吸道病原体中占比越来越大，并且存在多重感染的情况。因此实现快速检测，多病原体检测已成为趋势。

目前临床上应用的鉴定病原体的方法主要是依靠培养检测，但是培养法检测时间差，准确性低，同时呼吸道病原体很多较难培养。而且该类疾病具有相似的临床症状和流行性特征，并且存在多重感染的情况。

呼吸道联检试剂Pneumoslide为西班牙VIRCELL公司生产，1卡可同时检测人血清中呼吸道感染9项IgM抗体，包括嗜肺军团菌1型(LP1)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒(PIV)，但结果需用免疫荧光显微镜观察，对辨别阴阳性需要较长时间进行分辨。

微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，用以取代常规分子生物学、化学、免疫学或药物分析反应，并可实现多通量或高通量反应使得实验检测成本大幅降低，显著提高效率。

环介导恒温扩增根据链置换DNA聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)，利用链置换DNA聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物，提高扩增效率，优于PCR。

相关呼吸道病原体检测技术主要为间接免疫荧光法，胶体金法、酶联免疫法以及荧光PCR法。其中，间接免疫荧光法判定结果需要借助荧光显微镜，而且判定结果需要检测人员经验丰富；胶体金检测虽然快速，但是灵敏度不高，容易出现假阴性结果。酶联免疫检测的特异性和灵敏度不高，操作过程繁琐，耗时费力。荧光PCR法能够较准确的检测病原体核酸，但多重荧光PCR产品检测靶点最多3个，检测时间长，检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测，需要专业人员操作特定检测仪器等问题。

目前许多研究将环介导恒温扩增与微流控芯片结合，对病原体核酸、肿瘤标记基因、耐药位点等进行快速检测，但是以上研究需要借助其他仪器对结果进行判定。

因此，目前面临的技术性难点在于研发一款在可以同时检测多种呼吸道病原体，并且便于判定结果的系统。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒和方法，其采用微流控芯片实现7种感染率较高的非典型呼吸道病原体(肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲/乙型流感病毒(IFA&IFB，共检)、副流感病毒(PIV))的并行分析，并同步肉眼显色判定，提高呼吸道相关病原体的检测通量以及可操作性，降低成本，缩短检测时间。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组中的至少一组；

其中，所述肺炎支原体引物组包括SEQ ID NO：1所示的肺炎支原体外引物1、SEQ ID NO：2所示的肺炎支原体外引物2、SEQ ID NO：3所示的肺炎支原体内引物1和SEQ ID NO：4所示的肺炎支原体内引物2；

其中，所述肺炎衣原体引物组包括SEQ ID NO：5所示的肺炎衣原体外引物1、SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体外引物2、SEQ ID NO：7所示的肺炎衣原体内引物1和SEQ ID NO：8所示的肺炎衣原体内引物2；

其中，所述甲/乙型流感病毒引物组包括SEQ ID NO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQ ID NO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQ ID NO：11所示的甲/乙型流感病毒内引物1和SEQ ID NO：12所示的甲/乙型流感病毒内引物2；