[发明专利]一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用，属于生物分子检测技领域术。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命和健康的恶性疾病之一。目前，临床诊断方法主要是依靠影像学检测肿瘤细胞的形态，分辨率低。肿瘤标志物作为肿瘤诊断的一项重要指标，其检测对疾病的早期诊断与治疗，且对预后有着十分重要的意义。已经发现的肿瘤标志物有100多种，但是癌症患者早期体内的肿瘤标志物数量一般非常少，常规的检测方法难以对其进行精确定量分析。因此，寻找可选择性肿瘤标志物的识别探针，建立灵敏度高、特异性好的肿瘤标志物新方法，对癌症的早期诊断及治疗具有非常重要的科学意义和临床价值。

发明内容

为提高检测溶菌酶的灵敏度，本发明人之前提出一种技术方案，包括：利用适体与靶蛋白的特异性结合作用，将与适体杂交互补的DNA S1释放出来进一步与固定在电极表面的发卡探针结合，在限制性内切酶的作用下，通过特异性识别位点剪切释放引发链，同时将互补DNA S1释放出来形成循环放大，在T4连接酶和DNA聚合酶的作用下发生滚环复制放大反应，形成一条具有大量重复序列的单链，利用生物素标记信号探针将亲和素标记的HRP捕获到芯片表面，进而引发生物催化沉淀反应，增加芯片的质量，从而对蛋白质进行检测。

然而经过发明人的分析，发现DNA S1与发卡DNA杂交，当限制性核酸内切酶存在时，在识别位点处剪切，打开发卡DNA，释放出被剪切的DNA S1片段，虽然能够与其他发卡DNA杂交，但没有限制性核酸内切酶的识别位点，从而不能被剪切，所以其循环反应性能不够优良，从而导致灵敏度较低。

发明人发现此问题后，对之前的技术方案做了多种改进处理，然而在检测方法中采用“主DNA、助理DNA和发卡DNA互补杂交形成Y型结构”的技术方案，意外发现该检测方法对溶菌酶可检测到1.0×10^-16mol/L，灵敏度比先前工作提高10倍，具有突出的有益效果。经发明人分析可得，这是由于形成Y型结构的增强杂交过程使得信号得到增强，从而提高检测灵敏性。

本发明采用的技术方案具体如下：

本发明的第一个目的是提供一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法，该检测方法包括：将连接有磁珠载体的溶菌酶适体与主DNA部分互补杂交，通过溶菌酶与溶菌酶适体的特异性结合反应，将主DNA释放出来；主DNA与助理DNA和连接有金片的发卡DNA互补杂交形成Y型结构；在限制性核酸内切酶作用下，通过特异性识别位点剪切打开发卡DNA，并游离出完整的主DNA循环使用，完整的主DNA与其他发卡DNA和助理DNA形成模板增强杂交；在DNA连接酶和DNA聚合酶的作用下，以锁扣环状DNA为模板链，沿被打开的发卡DNA聚合生长，形成一条具有若干段重复序列的DNA单链；标记有生物素的信号探针与生成的DNA单链中的重复序列杂交互补，并与HRP标记的链酶亲和素结合后催化过氧化氢氧化4-氯萘酚发生沉淀反应，从而增加了金片表面质量，实现QCM对溶菌酶的高灵敏检测；其中，

所述主DNA包括相互连接的第一段主DNA和第二段主DNA，所述第一段主DNA与部分溶菌酶适体序列互补杂交；

所述助理DNA包括相互连接的第一段助理DNA和第二段助理DNA，所述第二段助理DNA与部分第一段主DNA序列互补杂交；

所述发卡DNA中环状序列中包含限制性内切酶的特异性识别位点，部分环状序列能与第二段主DNA互补杂交，部分环状序列能与第一段助理DNA互补杂交，从而形成Y型结构。

所述方法为非疾病诊断与治疗方法。

本发明的第二个目的是提供一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测试剂盒，其包括：

连接有磁珠载体的溶菌酶适体、主DNA、助理DNA、连接有金片的发卡DNA、核酸内切酶；

滚环复制放大反应体系：包括用于滚环复制放大的锁扣环状DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶和扩增原料dNTPs。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明提出一种利用多种信号放大技术高灵敏检测溶菌酶的QCM传感系统及检测方法，首先，本发明采用主DNA、助理DNA和发卡DNA互补杂交形成Y型结构，增强杂交过程使得信号得到增强；其次，本发明采用滚环复制放大反应得到具有大量重复序列的的DNA长链，进一步使得信号得到增强；再者，本发明将HRP通过生物素与亲和素的特异性结合修饰在DNA长链上；最后，经过一系列信号方法技术后采用QCM进行检测。