[发明专利]葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的制备技术领域，尤其是无载体共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶在催化氧化葡萄糖酸或盐中的应用。

背景技术

葡萄糖酸或盐，是一类重要的有机化学品，在食品、医药、化工等行业有着广泛的应用。如葡萄糖酸钙在临床和医药领域有着广泛用途；葡萄糖酸钠可用于涂镀特殊金属前钢坯的清洗，以增强镀层金属和钢铁表面的结合力；葡萄糖酸是五羟基己酸，可作为食品添加剂、医药中间体或清洗剂，用途广泛。

目前国内外生产葡萄糖酸主要是葡萄糖为底物转化制备葡萄糖酸，其生产方法有化学催化法、电解氧化法、发酵法和酶法。化学法生产葡萄糖酸或盐，成本昂贵，且催化剂制备工艺复杂，制约其工业化应用；电解法副产物少，但是耗能多、工艺复杂，也很难用于工业化生产；发酵法生产葡糖酸或盐过程中由于会产生副产物，増加了提取难度，降低了葡萄糖的转化率。而酶催化的生产方法，反应条件温和、产物单一，不仅节省时间和降低成本，而且可以提高转化率和产物纯度，已经收到广泛关注。

交联酶聚体一种无载体固定化方法，指利用双功能试剂酶聚集进行交联而得到固定化酶的方法，不需要不溶性材料作为载体。与载体固定化相比，交联酶聚体优势明显：(1)交联酶聚体比表面积大，催化效率和酶活回收率更高；(2)交联后美的结构更加稳定，有利于工业化生产。交联酶聚体的制备分为沉淀和交联两步，首先利用蛋白质沉淀剂(中性盐、水溶性有机溶剂、非离子型高聚物等)将溶解状态的酶进行物理沉淀得到酶沉淀聚体，随后用交联剂(常为戊二醛与酶聚体分子上的氨基发生schiff base反应，从而制得颗粒大小为1～200μm的水不溶性交联酶聚集体。理论上，CLEAs的方法固定的酶全部可以发挥催化作用，酶活回收率可以超过100％。由此可见，CLEAs技术有可能发展成为一种从宏观上提高酶活及选择性的修饰方法。目前对CAT/GOx固定化大多是树脂或其他载体进行先吸附后交联，关于交联酶聚集体研究相对较少，因此制备CAT/GOx交联酶聚体，并对其性质和机理进行研究，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体。

本发明还要解决的技术问题是提供上述葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体的制备方法，以克服现有技术中载体固定化成本高、酶活回收率低的缺点。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体在制备葡萄糖酸或葡萄糖酸盐中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶溶于水中，按照葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶的酶活比为1：1～20的比例混合，得到酶混合溶液；

(2)向步骤(1)得到的酶混合溶液中加入蛋白保护剂，得到溶液A，所述的蛋白保护剂为：伴刀豆蛋白A(ConA)、聚赖氨酸(EPL)、PEG-NH₂、牛血清蛋白(BSA)、海藻糖或聚乙二醇，

聚赖氨酸的分子量为3000，PEG-NH₂的分子量为6000，聚乙二醇的分子量为10000；

(3)向步骤(2)得到的溶液A中加入沉淀剂和交联剂，得到溶液B，所述的沉淀剂为无水乙醇或异丙醇；所述的交联剂为戊二醛、香草醛、PEG-CHO中的一种或几种的混合物；

(4)向步骤(3)得到的溶液B中加入还原剂，所述的还原剂为硼氢化钠或氰基硼氢化钠，反应，收集固形物，用磷酸缓冲液洗涤，既得到葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶的交联酶聚体。

不但可以提高交联效率，同时对于提高酶活回收率有重要影响，本发明中加入的蛋白保护剂为：伴刀豆蛋白A、聚赖氨酸、PEG-NH₂、牛血清蛋白、海藻糖或聚乙二醇。

伴刀豆蛋白A(ConA)作为一种凝集素，对含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特异性的亲和力，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按照一定的方向排列，使底物易进入到酶的活性位点，从而改善酶的酶学性质。

聚乙二醇(PEG)分子末端有两个能被活化的-OH基团，能够与水形成氢键，使其具有良好的水溶性，是一种被广泛使用的化学修饰材料。PEG分子链上含有大量的羟基，多羟基的醇类能够与水分子结合，降低介质的介电常数，提高酶分子的疏水特性，从而提高酶的稳定性。