[发明专利]一种反光素蛋白的提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，提供了一种反光素蛋白的提取方法，包括步骤：培养表达反光素蛋白的菌株，收获菌体并超声裂解；离心获得沉淀后在多种缓冲液中重悬、温育并纯化。利用本发明的方法能够获得具有活性的可溶形式的反光素蛋白，为研究反光素蛋白的性质以及更好地使用反光素蛋白提供了有利条件。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及反光素蛋白的提取。

背景技术

头足类动物(包括章鱼、墨鱼和鱿鱼)能够快速地调节自身皮肤的颜色，从而与环境融为一体进行隐蔽，或者与环境形成鲜明的对比，达到警戒猎食者保护自身不受攻击的效果。头足类动物这种动态的颜色变化主要原因之一是由细胞组织中有序排列的微观结构对光线的物理作用而产生的结构性色彩。负责这种动态的结构性色彩的微观结构是由一种特殊的蛋白质——反光素蛋白(reflectin)组成的。反光素蛋白在头足动物的细胞组织中广泛分布，并且具有多种形态和组装类型，它们的光学性质已经被广泛研究，然而关于这个蛋白的结构以及由反光素蛋白引起的结构色的内在复杂分子机制所知甚少。如果能够得到反光素蛋白的结构以及分子组装形式，对于理解头足动物动态结构色的变化具有重要的意义，而最关键的一步是得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

目前获得反光素蛋白的方法主要是利用包涵体变性的方法纯化重组表达的反光素蛋白，包括：培养表达反光素蛋白的菌株、收获菌体并超声裂解，利用尿素和盐酸胍将包涵体彻底变性，然后通过镍柱亲和层析以及反相色谱柱进行纯化。蛋白所在的溶液环境始终含有变性剂盐酸胍或者其它有机溶剂(如乙腈)，所以得到的反光素蛋白是只有一级结构的线性分子，不具有生物活性。同样地，由于反光素蛋白在生理条件以及一般实验所用到的各种缓冲液中都具有极低的溶解性，其它的提取蛋白质的方法也都无法得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的上述问题，提供一种能够获得具有活性的可溶形式的反光素蛋白的方法。

本发明的反光素蛋白的提取方法包括以下步骤：

1)培养表达反光素蛋白的菌株，收获菌体并超声裂解；

优选地，所述表达反光素蛋白的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其包含表达载体pCOLD1，所述表达载体包含编码反光素蛋白的基因；进一步优选地，所述编码反光素蛋白的基因为SoRef2基因，所述基因的序列如GenBank ID：HE687200.1所示；

优选地，当所述菌株在OD600达到0.6-0.8时，在288K的温度下利用终浓度为20μM的IPTG诱导20小时；

优选地，在诱导表达并收获菌体后，将菌体重悬于缓冲液T中，置于冰上超声裂解，所述缓冲液T包含20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0；优选地，超声裂解的参数为：200-220w，工作时间10s、间隙时间5s，循环100次；

2)离心步骤1)得到的裂解液，收集沉淀，将沉淀重悬于缓冲液R中，温育30min～1h，再次离心并收集沉淀，所述缓冲液R包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.3％～1％(体积比)Triton X-100，pH 8.0；优选地，所述缓冲液R包含20mM Tris、150mM NaCl、0.5％TritonX-100，pH 8.0；优选地，所述温育在旋转摇床中室温下进行；优选地，所述离心为15000rpm，30min；

3)将步骤2)得到的沉淀清洗三次，优选地，使用超纯水清洗；然后重悬于缓冲液S中，温育30min以上，离心，所述缓冲液S包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述缓冲液S包含20mM Tris、150mM NaCl、0.05％SDS，pH 8.0；优选地，所述温育在旋转摇床中室温下进行；优选地，所述离心为15000rpm，30min；